Введение к работе
Актуальность проблемы. Тромбин - ключевая пептидаза каскада свертывания крови, катализирующая гидролиз фибриногена до фибрина. Фибрин ассоциирует в фибриновые нити — каркас тромба. Избыточное тромбообразование приводит к сердечно-сосудистым заболеваниям с высокой смертностью и инвалидизацией, что обуславливает неугасающий интерес к антитромботическим препаратам, в частности, к ингибиторам тромбина.
Для клинического применения одобрены ингибиторы тромбина разной природы: полисахариды (гепарины), белки (гирудин, антитромбин III, бивалирудин) и пептидомиметики (аргатробан, дабигатран). Они обладают рядом недостатков: гепарин вызывает геморрагические осложнения, а остальные не имеют «антидота», что осложняет корректировку неудачно подобранной дозы; белковые ингибиторы могут вызывать иммунный ответ.
Поиск безопасных антикоагулянтов привел к получению ингибитора тромбина на основе дезоксирибоолигонуклеотида — 15-ТВА (минимального фармакофора). Этот 15-мер образует G-квадруплексную структуру, которая связывается с фибриноген-связывающим сайтом (экзосайтом I) тромбина с кажущейся константой диссоциации 24 нМ и ингибирует свертывание крови in vitro и in vivo. Однако, клиническое применение 15-ТВА ограничено его малым временем выведения - 5 минут; повышение массы олигонуклеотидов увеличивает этот параметр. Поэтому дополнительные элементы вторичной структуры к 15-ТВА могут улучшить его свойства: примеры более активных ингибиторов — аптамеры 31-ТВА и NU172. Низкая токсичность и иммуногенность, возможность масштабного химического синтеза и направленной модификации, наличие «антидота» (комплементарной последовательности) — это преимущества нового поколения ингибиторов тромбина.
Поскольку гидролиз низкомолекулярных субстратов не ингибируется лигандами к экзосайтам тромбина, кинетика ингибирования аптамерами не изучена. Потому представляется актуальной разработка метода, основанного на гидролизе фибриногена, для изучения эффективности и механизма действия аптамеров. Изучение кинетики ингибирования тромбина серией аптамеров позволит выяснить роль дополнительных элементов вторичной структуры, оптимальные условия для образования G-квадруплексного фармакофора, механизмы ингибирования и исследовать действие «антидота».
Цель и задачи исследования. Цель — изучение кинетики ингибирования тромбина аптамерами в сравнении с известными ингибиторами, выявление механизма и детерминант ингибирующей активности.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
-
Разработать метод, основанный на гидролизе фибриногена тромбином, для изучения аптамеров к тромбину.
-
Верифицировать метод на хорошо изученных ингибиторах тромбина.
-
Сравнить ДНК- и РНК-аптамеры с известными ингибиторами.
-
Выявить влияние катионов и дополнительных элементов вторичной структуры на активность фармакофора.
-
Изучить особенности ингибирования тромбина аптамерами в биологических жидкостях in vitro и in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы. Обзор литературы показал, что тромбин-катализируемый гидролиз фибриногена может быть основой эффективного метода оценки ингибиторов тромбина, включая аптамеры. Изучение гидролиза фибриногена несколькими методами — разделение фибринопептидов, исследование фибриновых ассоциатов, получение турбидиметрических кривых и теоретическое моделирование реакции - показало, что поставленная задача может быть реализована турбидиметрическим методом при условии его параметризации. Показано, что
параметр ^Wmax / tmax (где Wmax - максимальная скорость прироста мутности
раствора, а tmax - соответствующее время) пропорционален активности
тромбина. Метод позволяет охарактеризовать все классы ингибиторов тромбина, а также ингибиторы ассоциации фибрина. Полученные данные согласуются с данными других методов, а данные о типах ингибирования существенно углубляют понимание механизмов ингибировании гидролиза для низко- и высокомолекулярных субстратов.
Впервые изучено ингибирование тромбина аптамерами. ДНК-аптамеры отличаются от РНК-аптамера к экзосайту II тромбина по типу ингибирования (полное vs неполное ингибирование). В аптамерах 31-ТВА, NU172 и RA-36 дополнительные элементы вторичной структуры к G-квадруплексному фармакофору уменьшают константу ингибирования и определяют тип ингибирования. Высокая активность аптамеров определяется сочетанием элементов: петли с фармакофором (NU172) либо петли и дуплекса (31-ТВА). Для нового аптамера RA-36, показано, что он содержит два G-квадруплексных фармакофора с разной функциональной активностью.
Определены оптимальные условия образования фармакофорного G-квадруплекса. Конформационная подвижность G-квадруплекса необходима для его ингибирующей активности.
Аптамеры 15-ТВА и RA-36 конкурируют за сайт связывания с гиругеном — пептидом, аффинным к фибриноген-связывающему сайту (экзосайту I) тромбина. 15-ТВА выступает активатором в гидролизе тромбином низкомолекулярного субстрата. В присутствии 15-ТВА и гиругена наибольшая активация достигается для частично деструктурированного тромбина (без натрия и с дитиотреитолом).
Видоспецифичность аптамеров определяется в большей мере дополнительными элементами вторичной структуры, чем фармакофором. Аффинность аптамеров к проформе тромбина — протромбину — также определяется дополнительными элементами вторичной структуры и падает в ряду NU172 - 31-ТВА - 15-ТВА - RA-36. Для RA-36 исследовано действие антидота (комплементарного олигонуклеотида), установлена стехиометрия 1:1. RA-36 был исследован при внутривенном, подкожном и внутримышечном введении крысам, показано сохранение активности in vivo и увеличение времени выведения по сравнению с 15-ТВА более чем в 3 раза.
Полученные в настоящей работе данные позволяют понять, как аптамеры ингибируют тромбин, и как можно их улучшить. Разработанный метод позволил изучить специфичность и видоспецифичность аптамеров. Работа дает уникальную возможность изучения аптамеров к тромбину, а также проясняет некоторые аспекты механизмов ингибирования и активации фермента.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных периодических изданиях, получен 1 патент. Результаты были представлены на конференциях «Ломоносов-2010» (Москва, Россия, 2010 г.), «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, Россия, 2010 г.), «V Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии» (Москва, Россия, 2011 г.), «XVIII Всероссийский национальный конгресс «Человек и Лекарство» (Москва, Россия, 2011 г.), «Ломоносов-2011» (Москва, Россия, 2011 г.), «60th International Congress of the European Society for Cardiovascular and Endovascular Surgery» (Москва, Россия, 2011 г.), «XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis» (Киото, Япония, 2011 г.), «17th Congress of European Hematology Assоciation» (Амстердам, Нидерланды, 2012).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен ингибиторам тромбина), обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 84 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 295 цитированных работы.
