Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов функционирования системы трансдукции светового сигнала в фоторецепторных клетках сетчатки является одной из важнейших задач молекулярной биологии и биохимии.
В последнее десятилетие во многих лабораториях получены экспериментальные данные, вскрывающие молекулярные основы зрительного возбуждения. По мере понимания механизма передачи зрительного сигнала внимание обращается и на пути, которыми трансдукция модулируется. Зрительная система позвоночных работает в диапазоне освещенностей, перекрывающем 12 порядков. Частично эта способность обеспечивается механизмами адаптации на уровне фоторецепторов.- Существуют два основных проявления адаптации к повышению фоновой освещенности -десенситизация и выход из насыщения. Это дает возможность фоторецептору приспособить свою чувствительность в соответствие с интенсивностью окрукающего освещения.
Считается, что процесс адаптации обеспечивается обратной связью посредством ионов кальция, концентрация которых в цитоплазме при освещении падает. Снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция происходит в результате закрытия цГМФ-зависимых каналов в плазматической мембране НСП и непрерывной работы Ш+/К+,Са2+-обменника. Накопленные данные показывают, что такое снижение концентрации кальция переключает механизм обратной связи процессов темнового восстановления и световой адаптации. Электрофизиологические и биохимические исследования показывают, что концентрация кальция влияет на гуанилатциклазу фоторецепторов таким образом, что при снижении' внутриклеточного уровня кальция
происходат увеличение синтеза цГМФ. Кроме того, кальциевой обратной связью, по-видимому, можно объяснить кинетику ответа при действии фона, а также отличие в быстродействии между палочками и колбочками.
Фосфодиэстераза цГМФ (ФДЭ) также чувствительна к внутриклеточной концентрации кальция. Было показано, что кальций в физиологических пределах' регулирует световую активацию ФДЭ сетчатки лягушки. Чувствительность и гуанилатциклазы, и ФДЭ к уровню кальция опосредуется .растворимыми белками с молекулярной массой 26 кДа, обнаруженными в сетчатках быка и лягушки.
Цель работы. Данная работа проводилась в рамках осуществляемых в МБХ имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН комплексных структурно-функциональных исследований белков светочувствительных систем.
Целью настоящей работы являлось клонирование, определение первичной структуры кальцийсвязывавдего белка с молекулярной массой 26 кДа из сетчатки быка (обозначаемый в дальнейшем как Р26), с последующей экспрессией.
Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирована кДНК, кодирующая белок с молекулярной массой 26 кДа Из НСП сетчатки быка . После определения -первичной структуры -белка Р2б' и соответствующей кДНК были сосредоточены усилия на изучении структурных основ функционирования этого белка. Удалось экспрессировать в клетках Е.соИ химерный белок, состоящий из фрагмента белка А, последовательности, специфично расщепляемого энтвропептидазой, и белка Р26.
Дубликации. По материалам диссертации опубликовано Z статьи, результата исследований докладывались на VIII симпозиуме ФРГ-СССР "Химия пептидов и белков" (ФРГ,1991).
Объем работы. Диссертация изложена на 9S страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (/< ссылок).