Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из актуальных направлений Оиоорганической химии является структурно - функциональное исследование белков, 'принимающих участие в процессах восприятия, передачи и усиления зрительного сигнала. Ключевыми белками зрительного каскада позвоночных, локализованными в фоторецепторных клзтках, являются такие белки как родопсин, трансдуцин и фосфодиэстераза циклического гуанозинмонофосфата (ЦГМФ). Активируемая фотовозбувденным родопсином при посредстве ГТФ. - связывающего белка трансдуцина, цГМФ фосфодиэстераза (цПй ФДЭ) быстро гидролизует вторичный мессендаер цГМФ.что приводит к закрытию большого числа натриевых каналов в цнтоплазматической мембране, ее гиперполяризациии возникновению электрического сигнала, который передается другим клеткам.
цГМФ фосфодиэстераза палочек сетчатки состоит из двух больших родственных субъединиц а- и р, с молекулярными массами, по данным электрофореза в sDS-полиакржламидном геле 84 и 88 кДа, соответственно. Маленькая субъединица - т (II кДа) -является внутренним ингибитором фермента: Для детального выяснения механизмов функционирования белков зрительного каскада необходимо иметь полную информацию об их структурной организации.
Ранее методами белковой химии были.изучены первичные структуры родопсина и 7-субъединицы трансдуцина. Генно-инженерными методами определена нуклеотидная последовательность генов родопсина, а- , 0- и т-субъединиц трансдуцина. Параллельным анализом белка и соответствующей ему кДНК также были установлены полные первичные структуры а, т-субъединиц цГМФ фосфодиэстеразы из палочек сетчатке быка и нуклео-
- г -
тидная последовательность 5'-области кДНК р-субъединицы.
Цель работы. Данная работа является частью исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР, по комплексному структурно - функциональному изучению цГМФ фосфодизстеразы из сетчатки крупного рогатого скота. Целью представленной работы являлось клонирование кДНК из сетчатки быка; поиск клонов, содержащих фрагменты кДНК /з-субъеди-ницы цГМФ фосфодизстеразы и выведение на основании полной нуклеотидной последовательности кДНК аминокислотной последовательности данной субъединицы.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе клонированы фрагменты кДНК, содержащие 45 % структурной части гена е-субъединицы фосфодизстеразы циклического гуанозинмонофосфата ( 1196 п.о.), а также З'-нетрансли-руемая область (400 п.о.) и определена их полная нуклеотидная последовательность.
С учетом ранее клонированных в лаборатории фрагментов кДНК была реконструирована полная нуклеотидная последовательность кДНК р-субъединивд цГМФ ФДЭ длиной ЗОН п.о. Выведенная на основе нуклеотидной,аминокислотная последовательность фермента содержит 853 аминокислотных остатка. Вычисленная молекулярная масса - 98 308 Да.
Показана высокая степень гомологии с а-субъединицей фермента и о'-субъединицей цГМФ ФДЭ из колбочек сетчатки быка, также с рядом других представителей семейства фосфодиэстераз циклических нуклеогидов. На основании выявленной гомологии в С-концевой области -субъединицы локализован район, в котором
- з -располагается каталитический центр гидролиза цГМФ. Полученные результаты позволили начать работы по реконструкции полноразмерной кДНК э-субъединицы цГМФ ФДЭ и ее экспрессии. Кроме того, клонированные фрагменты дают возможность вести работы по исследованию структуры фосфодиэстераз из различных организмов и, прежде всего, из человека.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты работы докладывались на 5 и 6 Конференциях молодых ученых социалистических стран (Пушино, 1988г. и Прага, 1989г.), на 14 Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988г.) и на Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990г.).
Объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуадения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылок).
