Введение к работе
Актуальность проблемы. Долгие годы основным аспектом исследования ферментов систем рестрикции-модификации ДНК П-го типа являлось изучение белково-иуклеинового узнавания, связанного с выполнением их непосредственных функции -гидролиза ДНК или метилирования одного из основании в цепи ДНК в строго определенном месте. Однако, в последнее время системы рестрикции-модификации все больше привлекают исследователей с точки зрения характеристики регуляции экспрессии генов, которая играет чрезвычайно важную роль при функционировании этих систем в клетках бактерий. Это связано с тем, что эндонуклеазы рестрикции представляют собой белки, потенциально опасные для экспрессирующей их клетки-хозяина. Нарушение функции специфического метилирования ДНК клетки-хозяина может приводить к фрагментированию ДНК эндонуклеазами рестрикции и последующей гибели клетки. Поскольку многие системы рестрикции-модификации определяются автономно реплицирующимися элементами - плазмидами и вирусами, можно предположить, что при их переносе из одного организма в другой регуляция экспрессии генов метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции должна осуществляться самой системой. Исследования систем рестрикции-модификации П-го типа, проводимые в последнее время, показали, что механизмы регуляции активности генов в этих системах различны и требуют детального изучения.
Объектом нашего исследования является система рестрикции-модификации SsoU, обнаруженная в штамме Shigella sonnet 47. Отличительной особенностью системы Ssoll является дивергентное расположение генов эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы, которые разделены небольшим межгенным участком, что делает эту систему особенно привлекательной с точки зрения исследования регуляции экспрессии генов.
К началу выполнения настоящей работы была показана авторегуляторная роль метилтрансферазы EcoRll и было высказано предположение о том, что метилтрансферазы dcm и Mspl также могут выполнять регуляторную функцию (Som et al., 1994). Этот факт расширяет существующие воззрения на узнавание метилтрансферазами последовательностей ДНК, и позволяет предположить существование двух типов ДНК-белковых взаимодействий метилтрансфераз - с участком метилирования и с промоторной областью собственного гена. Несмотря на то, что
генетическая организация этих систем рестрикции-модификации различна, узнаваемые в двутяжеиой ДНК последовательности всех трех метилтрансфераз - coRII (5'-...CCA/TGG...-3'), dcm (5'-...CCA/TGG...-3') и Mspl (54..CCGG...-3'), похожи на участок узнавания метилтрансферазы Ssoll (5'-...CCNGG...3', где N - A, G, Т или С), и все три фермента модификации, также как и метилтрансфераза Ssoll, метилируют внутренний цитозин узнаваемой последовательности с образованием 5-метилцитозина (5МЦ). Более того, аминокислотные последовательности этих метилтрансфераз высокогомологичны. На основании этих данных можно предположить возможность регуляции экспрессии генов, основанной на авторегуляторной функции метилтрансферазы, для системы рестрикции-модификации Ssoll. Актуальным является выяснение вопроса о существовании общего механизма регуляции экспрессии генов у ряда родственных систем рестрикции-модификации, в основе которого лежит взаимодействие метилтрансферазы с промоторной областью собственного гена. Такая регуляция может быть существенна как при проникновении системы рестрикции-модификации в клетку, так и в последующем - для выполнения функции защиты клетки бактерии-хозяина от проникновения чужеродной неметилированной ДНК.
Цель работы. Изучение механизма регуляции в системе рестрикции-модификации Ssoll, исследование взаимодействия метилтрансферазы Ssoll с межгенной областью этой системы.
Научная новизна и практическая ценность. Исследована регуляция экспрессии генов в системе рестрикции-модификации Ssoll. Показано, что метилтрансфераза Ssoll (M.&oII) может выполнять регуляторную функцию: снижать экспрессию собственного гена и повышать экспрессию гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции Ssoll (R.SsoII). Установлено, что регуляторная функция М.5го11 определяется N-концевым доменом. В этой части молекулы с помощью компьютерного анализа с высокой вероятностью предсказан потенциальный участок связывания ДНК, представляющий собой модуль "спираль-поворот-спираль", характерный для многих ДНК-связываюших белков. Показано, что М.&ОІІ способна формировать специфический и стабильный комплекс с межгенной областью системы рестрикции-модификации Ssoll. Локализован участок ДНК, с которым взаимодействует фермент, а также выявлены нуклеотидные остатки ДНК, которые вовлечены во взаимодействие или сближены с М.&оІІ. Предложен метод определения констант равновесного ДНК-белкового связывания, основанный на вытеснении специфического ДНК-дуплекса с известной константой
связывания _ неспецифическими -- ДНК-дуплексами"""" или ^ДНК-дуплексами с модифицированным участком связывания. Анализ подученных в работе данных позволяет предположить существование общего механизма регуляции у ряда родственных систем рестрикции-модификации ДНК. В основе тгого механизма лежит специфическое взаимодействие метилтрансферазы с собственной промоторной областью, которое обеспечивает репрессию синтеза метилтрансферазы а процессе функционирования системы рестрикции-модификации в клетке.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на конференции FASEB "Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты" (Вермонт, США, 1996) и 4-ом рабочем совещании New England Biolabs по биологической модификации ДНК (Игле, Австрия, 1997).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на'-^страдицах машинописного текста и содержит следующие разделы: обзор литературы (посвящен регуляции жемрессии генов прокариот, опосредованной ДНК-белковыми взаимодействиями), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (172 ссылки), содержит 44 рисунка и S таблиц.
