Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы в ряду терапевтических препаратов все более заметное место занимают иммуномодуляторы различной природы. Среди них эндогенные иммуномодуляторы (цитокины иммунной системы, пептиды тимуса и костного мозга), синтетические соединения (полиоксидоний, полинуклеотиды) и, наконец, некоторые бактериальные продукты. К последней группе относятся прежде всего мурамоилпептиды -фрагменты муреина, пептидогликана клеточной стенки бактерий, и их синтетические аналоги и производные.
Мурамоилпептиды (МП)' - класс соединений, открытый в 70-х годах французскими учеными во главе с Э.Ледерером в результате поиска минимального иммуноактивного фрагмента клеточных стенок микобактерий, входящих в состав полного адъюванта Фрейнда. Этим минимальным фрагментом, способным заменить в адъюванте целые микобактерий, оказался г-і-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутамин (мурамоилдипептид, МДП). Исследование свойств полученного синтетическим путем МДП продемонстрировало, что помимо адъювантной активности для него характерны способность стимулировать неспецифическую резистентность организма к бактериальным и вирусным инфекциям, а также пирогенный и сомногенный эффекты. Таким образом, МДП влиял как на неспеиифические иммунные реакции, так и на адаптивный иммунитет.
В последующие два десятилетия в различных лабораториях мира были синтезированы сотни аналогов и производных МДП, некоторые из которых обладали еще и противоопухолевой активностью. Из этих соединений были
1 Список сокращений: МП - мурамоилпептиды; МДП - N-ацетилмурамоил-
р1--4-аланил-0-изоглутамин; ГМП - глюкозаминилмурамоилпептиды; ГМДП
N-ацетилглюкозаминил-рі—4-ІЧ-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамин;
L-ГМДП - Ы-ацетилглюкозаминил-р1--4-Ы-ацетилмурамоил-аланил-
изоглутамин; ГМДП-Lys - Ы-ацетилглюкозаминил-р1--4-Ы-аиетилмурамоил-аланил-О-кзоглутаминил-лизин; ГМДП-СООН - N-ацетилглюкозаминил-рі— 4-1Ч-ацетилмурамоил-аланил-0-глутаминовая кислота; МТР-РЕ мурамоилтрипептидфосфатидилэтаноламин; ОАА - опухолеассоциированные антигены; АГКГ - антигены главного комплекса гистосовместимости; МА -моноклональные антитела; SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; IL - интерлейкин.
отобраны перспективные лекарственные средства и адъюванты,
высокоактивные, не вызывающие серьезных побочных эффектов. В результате
проведенных клинических испытаний в медицинскую практику были
рекомендованы японский препарат ромуртид, способствующий быстрому
восстановлению уровня лейкоцитов в крови раковых больных после радио- и
хемотерапии, швейцарский противоопухолевый препарат
мурамоилтрипептидфосфатидилэтаноламин (МТР-РЕ), а также включенный Всемирной Организацией Здравоохранения в состав вакцины против беременности нор-мурамоилдипептид. На стадии клинических испытаний находится апирогенное производное МДП мурабутид.
Классические МП содержат лишь один углеводный остаток -N-ацетилмурамовую кислоту (MurNAc). В то же время минимальным повторяющихся фрагментом полисахаридной цепи муреина является дисахарид GlcNAc-pi--4-MurNAc. Гликопептиды, содержащие подобный олигосахаридный фрагмент, могут выщепляться из клеточной стенки бактерий в результате ферментативного гидролиза и поступать в кровоток (Gray, 1984), причем это может иметь место не только при инфицировании организма, но и в норме при деградации бактерий, населяющих желудочно-кишечный тракт. Данный факт позволил ЭДедереру выдвинуть гипотезу о том, что МП являются "витаминами" иммунной системы, поддерживающими иммунный статус организма. Свидетельством роли дисахарид-содержащих МП было обнаружение Пинегиным с соавт. (1995) в крови здоровых доноров антител к подобным структурам, но не к классическим МП.
Исследование свойств олигосахарид-, в частности, дисахарид-содержащих МП стало возможным благодаря разработке в лаборатории химии пептидов ИБХ им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН эффективного метода синтеза этих соединений. С использованием разработанного метода была синтезирована большая группа оригинальных МП. Оказалось, что дисахаридсодержащие МП в ряде случаев обладают более выраженными полезными свойствами, чем моносахарид-содержащие аналоги. В результате проведенного в России цикла работ на основе одного из них, N-ацетилглюкозаминил-рі—4-Ы-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамина
Glc NAc (pi-» 4)MurNAc
CH2OH СНгОН
^"-^^NAc^ ?^naV~0H p"c1- Структура ГМДП
H X n H H3C\* ch, H
;н О! CONHj : Ala .'D-Glu-NH2
(ГМДП, рис.1) был создан новый отечественный лекарственный препарат ликопид, рекомендованный в качестве иммунокоррегирующего средства при вторичных иммунодефицитах.
Несмотря на успехи в исследовании биологических свойств МП и в их практическом применении, молекулярный механизм активности МП оставался малоизученным. Спорным было наличие рецепторов МП на иммунокомпетентных клетках, противоречивыми были данные и о типах клеток, способных отвечать на МП, что делало актуальным решение вопроса об их молекулярных и клеточных мишенях.
Цели и задачи работы. Основной целью исследования явилось выяснение молекулярных основ иммуномодулирующсй и противоопухолевой активностей глюкозаминилмурамоилпептидов (ГМП). В ходе выполнения исследования решались следующие главные задачи:
1. Поиск и локализация ГМП-связываюших центров на клетках разной
этиологии.
2. Получение и характеристика свойств моноклональных анти-
идиотипических антител к ГМДП как инструмента изучения ГМП-
связываюших молекул.
3. Выделение и структурная характеристика рецепторных молекул.
4. Характеристика изменений в составе поверхностных рецепторов
клеток иммунной системы под действием ГМП.
5. Характеристика фенотипических изменений, вызываемых действием
ГМП на опухолевые клетки, и выяснение их функциональной значимости.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые продемонстрировано, что механизм биологической активности глюкозаминилмурамоилпептидов включает модификацию спектра поверхностных антигенов клеток-мишеней. В случае клеток миело-моноцитарного ряда это антигены класса II главного комплекса гистосовместимости и рецептор интерлейкина 2, отвечающие соответственно за презентацию антигенов Т-лимфоцитам и развитие иммунной реакции, в случае опухолевых клеток - антигены, существенные для распознавания опухолевых клеток иммунной системой (опухолеассоциированные антигены, молекулы адгезии). Доказана функциональная значимость подобных изменений.
Впервые показано, что не только макрофаги, но и Т-лимфоциты-хелперы, и опухолевые клетки имеют центры связывания ГМП, находящиеся внутри клеток. Определено их число и константы диссоциации. Продемонстрировано, что связывание ГМДП с внутриклеточными центрами макрофагов приводит к активации клеток, что доказывает сигнал-проводящую активность этих центров.
Впервые получены моноклональные анти-идиотипические антитела к ГМДП. Изучены их свойства, и выявлены антитела, связывающиеся с рецепторами ГМДП и имитирующие его адъювантную активность.
Впервые проведено выделение и структурная характеристика ГМП-связывающих белков. Выяснено, что одним из их типов являются гистоны HI. Доказано, что ГМДП способен конкурировать с ДНК за связывание с гистонами HI и что обработка хроматина ГМДП приводит к изменению доступности межнуклеосомных участков ДНК для расщепления микрококковой нуклеазой, то есть к изменениям в структуре хроматина. На основании полученных данных сформулирована гипотеза о том, что ГМП влияют на экспрессию поверхностных антигенов клеток-мишеней путем взаимодействия с гистонами HI, приводящего к обнажению регуляторних межнуклеосомных участков ДНК и инициации транскрипции.
Полученная информация может быть использована при разработке новых высокоэффективных препаратов на основе мурамоилпептидов. Разработанные подходы к оценке иммуномодулирующей активности ГМДП in vitro могут применяться для тестирования партий субстанции при
производстве лекарственного препарата ликопид и для характеристики пептидных иммуномодуляторов. Моноклональные антн-идиотипкческис антитела к ГМДП могут послужить основой для создания нового адъюванта. Моноклональные антитела к ГМДП уже используются для определения ГМДП в биологических жидкостях.
Апробация полученных результатов. Результаты проделанной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: VII Международном конгрессе иммунологов (Берлин, 1989), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), I Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка" (Москва-Ленинград, 1990), Международном симпозиуме "Проблемы иммунофармакологии" (Тбилиси, 1990), X Конференции Европейской федерации иммунологических обществ (Эдинбург, 1990), Международном симпозиуме "Современные тенденции в изучении лейкозов человека. IX." (Вилсед, 1990), XI Конференции Европейской федерации иммунологических обществ (Эспо, 1991), II Японско-советском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Киото, 1991), VIII Международном конгрессе иммунологов (Будапешт, 1992), Международном симпозиуме "Структура и функции регуляторных пептидов" (Москва, 1992), II Российско-израильском симпозиуме по белкам и пептидам (Москва, 1992), Международном симпозиуме "Иммунотерапия инфекций" (Берлин, 1994), Ш симпозиуме IUPAC по биоорганической химии (Дагомыс, 1995), симпозиуме "Пептиды в иммунологии" (Интерлакен, 1995), 1-ой национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (Москва, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 работы.
