Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекула РНК имеет сложную пространственную структуру, стабилизированную третичными взаимодействиями между петлями или одноцепочечными участками. Прочная структура РНК затрудняет создание терапевтических препаратов, способных инактивировать нуклеиновые кислоты инфекционных агентов и регулировать экспрессию генов. Несмотря на большой интерес к изучению различных параметров взаимодействия олигонуклеотидов (ON) с ДНК- или РНК- мишенями, детальный механизм взаимодействия олигонуклеотидов с природными высокоструктурированными РНК пока не был изучен в достаточной степени.
Цель настоящей работы состояла в детальном изучении механизма и
эффективности направленного воздействия на природные
структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались тРНКРЬе из дрожжей и ряд направленных к этой тРНК олигонуклеотидов.
В ходе исследования решались следующие задачи:
1) Оценка влияния антисмысловых олигонуклеотидов на
функциональную активность природной тРНКРЬе из дрожжей в реакции
аминоацилирования. Сравнение предельного уровня аминоацилирования
тРНК с данными по взаимодействию с ней олигонуклеотидов, полученных
при помощи метода задержки в геле.
-
Дизайн и препаративный синтез флуоресцентных производных олигонуклеотидов и РНК, которые позволили бы проводить прямой мониторинг взаимодействия олигонуклеотида с РНК. Оптимизация методики введения флуоресцентных групп в различные типы нуклеиновых кислот.
-
Детальное изучение кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с дрожжевой тРНК с помощью комбинации методов остановленной струи ("stopped-flow") и резонансного переноса энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Разработка математической модели для анализа кинетических данных по взаимодействию антисмыслового олигонуклеотида с тРНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Представленная работа является первым исследованием, в котором проведён детальный анализ кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с высокоструктурированной природной РНК в сочетании с изучением влияния олигонуклеотидов различной природы на функциональную активность этой РНК. Полученные данные позволили установить кинетическую схему процесса; рассчитать константы скорости всех стадий, входящих в эту схему; установить факторы, которые наиболее важны для специфического взаимодействия олигонуклеотидов с РНК-мишенями. Проведенное исследование позволяет понять роль
конформационных изменений в структуре РНК в процессе взаимодействия с олигонуклеотидами.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены в виде устных и постерных докладов на международных конференциях: "Chemical Probes in Biology", Спетцес, Греция, 2002; "Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference", Новосибирск, 2003; "5th Cambridge Symposium", Кембридж, Великобритания, 2003; "Chemical and biological problems of proteomics", Новосибирск, 2004; "International conference on chemical biology", Новосибирск, 2005.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 43 рисунка и 7 таблиц. Библиография включает 276 литературных источников.
