Содержание к диссертации
Введение
1 Аффинная модификация биополимеров фосфорилируюїдими реагентами и реагентами на основе 4-азидоарилфосфата и перфторарилазида 9
1 1 Аффинные реагенты с фосфорилирующей реакционноспособной группой и группой, потенциально способной к фосфорилированию 10
1 1 1 Фосфорилирующие аффинные реагенты - производные моно- и олигонуклеотидов, содержащие реакционноспособную группу на 5'-конце 10
1 1 2 Фосфорилирующие аффинные реагенты - производные нуклеиновых кислот, содержащие реакционноспособную группу в составе межнуклеотидной пирофосфатной связи 21
1 1 3 Фотоаффинные реагенты на основе я-азидофенил- и 4-азидо-2-нитрофенилфосфата 27
1.14 Механизмы окисления гиарохинонфосфоэфиров 32
1 2 Применение перфторированных арилазидов для фотоаффиниой модификации биополимеров 37
2 Результаты и их обсуждение 60
2 1 Механизм фотопревращения реагентов на основе л-азидофенилфосфата в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров 60
2 1 1 Синтез и фотопревращение (3-(4-азидофенилового эфира)1ЮР при его облучении в водном растворе при рН 78
2 1 2 Фотопревращение л-азидофенил фосфата при его облучении в водном растворе при рН 51 62
2 1 3 Фотопревращение л-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе при рН 9 6 64
2.1 4 Фото превращение л-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе с 2,6-ксилолом 67
2 1 5. Фотопревращение я-азидофенилфосфата при его облучении в присутствии лизина 68
2 2. Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковыми радикалами аминокислот в составе комплементарного комплекса 72
2 2.1 Получение фотоактивируємых производных олигонуклеотидов и конъюгатов олигонуклеотидов с соединениями, имитирующими функциональные группы белков 73
2 2 2 Внутрикомшіексное фотохимическое взаимодействие тетрафторазидобензоильной группы с боковыми радикалами аминокислот 78
2 3 Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковыми радикалами ароматических аминокислот в модельных соединениях 81
23 1 Синтез производных ароматических аминокислот, несущих остаток 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты 81
2 3 2 Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензоильной группы с остатком тирозина 82
2,3 3 Фотовзаимодействие я-азидоперфторбензоильной группы с остатком триптофана 87
3 Экспериментальная часть 96
3 1 Материалы и методы 96
3 2 Компьютерное моделирование модельных соединений (80) - (82) 98
3 3 Синтез я-азидофенилфосфата 99
3 4 Синтез Р-(4-азидофенил)уридин-5'-дифосфата (63) 99
3 5 Фотолиз и-азидофенилфосфата в карбонатном буферном растворе (рН = 9.6) 100
3 6 Выделение продуктов фотолитического разложения и-азидофенилфосфата в водном растворе (рН = 5.1) 100
3 7 Фотолиз й-азидофенилфосфата в присутствии лизина при рН 9 6 100
3 8 Синтез я-бензохинонмоноимина при рН 9 6 101
3 9. Фотолиз л-азидофе кил фосфата в водном растворе 2,6-ксилола 101
З.10 Получение цетавлоновой соли олигонуклеотидов 101
З.11 Получение фосфорилируюших производных моно- и олгонуклеотидов (77a)-(77sK)eDMF 101
3 12 Синтез 3'-(3-аминопропил)-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp (74) 101
З 13 Синтез 3'-(3-аминопропил)-&чидофосфата олигонуклеотида pGATACCAA 102
3 14 Синтез 3'-[2-(2-аминоэтилдисульфанил)-этил]-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp (76) 102
3 15 Синтез 3'-[3-(3-индолилацетиламидо)пропил]-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp (75) 102
3 16 Синтез 5'-[3-(4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбеизоиламидо)пропил]- амидофосфата олигонуклеотида pGATACCAA (73) 102
З.17 Внутридуплексная фотохимическая модификация 103
З 18. Синтез трет-бутилоксикарбоншіамино-(4-т/7іти-бутилкарбонилоксибензил)-уксусной кислоты (98) 103
3 19 Синтез jV-гидроксисукцинимидного эфира третбутилоксикарбониламино-(4-т/?ет-бутилкарбонилоксибензил)-уксусной кислоты (99) 103
3 20. Синтез ^-(3-аминопропил)-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (100) 104
3 21 Синтез /У-(2-аминоэтил)-4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензамида (Ю1) 104
3 22. Синтез #-(4-шинобутилН-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бенз&чида (102) 104
З 23 Синтез Д/'-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-зтил}-4- азидо-2,3,5,б-тетрафторбензамида(80) 104
З 24 Синтез ЛГ-{3-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-пропил}- 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида(81) 104
З 25 Синтез Лг-{4-[2-ашно-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-бутил}- 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида(82) 105
З 26 Синтез/У-{3-[2-амино-3-(1Я-шщол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-4- азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида(83) 105
З 27 Идентификация основных продуктов фотолиза соединений (80), (81), (82), (84) 105
Выводы 108
- Применение перфторированных арилазидов для фотоаффиниой модификации биополимеров
- Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковыми радикалами аминокислот в составе комплементарного комплекса
- Компьютерное моделирование модельных соединений (80) - (82)
- Синтез Д/'-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-зтил}-4- азидо-2,3,5,б-тетрафторбензамида(80)
Введение к работе
В настоящее время все возрастающую роль в исследовании структуры нуклеопротеидов и динамики процессов с участием надмолекулярных комплексов играют химические методы Особенно привлекательны в этом аспекте фотохимические методы, поскольку фотохимическое превращение можно осуществить за доли секунд, а именно в этом временном масштабе происходят многие биохимические события Часто при синтезе фотоаффинных реагентов используются арилазиды. Последние, как известно, обладают способностью модифицировать различные функциональные группы и, тем самым, позволяют получать наиболее полную информацию об окружении реагентов в области связывания [1]
Для исследования разных биологических систем используется широкий спектр ароматических азидов, различающихся типом заместителя в бензольном кольце. Фотореагенты на основе я-азидоарилфосфата хорошо зарекомендованій себя при изучении функционирования транскрипционного комплекса прокариот, а также для исследования важнейших биоэнергетических механизмов, локализованных в мембранах [2-5]. Фотоаффинные реагенты на основе и-азвдоперфторбензойной кислоты в настоящее время широко используются для изучения белково-нуклеиновых комплексов функционирующих в процессе матричного биосинтеза биополимеров [6-8] Несмотря на широкое применение ароматических азидов в фотоаффинном мечении белков, малоисследованными остаются процессы фотолиза арилазидов в водных растворах В большинстве случаев не установлено также и строение соединений, образующихся при взаимодействии белков с арилазидами в результате облучения.
На протя/кении ряда лет в Лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН проводится систематическое исследование механизмов фотоиндуцируемых реакций арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков К моменту проведения настоящей работы было обнаружено, что облучение в водных растворах двух типов арилазидов - л-азидоанилина и и-нитрозамещенных арилазидов приводит к образованию реакционноспособных соединений. Было установлено, что «темновые» процессы в фотоаффинной модификации белков при использовании и-нитрозамещекных арилазидных реагентов обусловлены образованием реакционноспособного ароматического нитрозосоединения [9] В случае реагентов на основе я-азидоанилина частицей, модифицирующей белки, .может быть производное я-бензохинондшшина [10, II]. Что касается реагентов на
основе перфторазидоарила и я-азидофенилфосфата, то для них до сих пор не установлена даже природа модифицированного аминокислотного остатка При этом некоторые экспериментальные факты свидетельствуют о том, что в случае реагентов на основе л-азидофенилфосфата в модификации белков могут принимать участие частицы не нитреновои природы Так, при фотомодификации тимидилатсинтазы 5-фтор-2'-дезоки-[6-3Н]-уридин-5'-(«-азидо-[2,6-|4С]-фенил)-фосфатом, авторы наблюдали включение в фермент либо арилазиднои, либо нуклеотидной части реагента в зависимости от условий проведения эксперимента [12] Таким образом, исследование фотохимического взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков является до сих пор актуальной задачей биоорганической химии.
Целью настоящей работы являлось установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия реагентов на основе 4-азидофенилфосфата и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты с функциональными групп белков
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
изучить продукты фотолиза реагентов на основе я-азидрфенилфосфата, образующиеся в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров,
сконструировать модельные системы, в которых я-азидоперфторбензоильная группа и аминокислотный остаток сближены на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков;
с использованием модельных систем изучить эффективность взаимодействия остатка 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты с функциональными группами определенного типа биополимеров и установить строение продуктов внутримолекулярной модификации по остаткам Туг и Тгр.
Применение перфторированных арилазидов для фотоаффиниой модификации биополимеров
Фотоаффинные реагенты на основе ароматических азидов нашли широкое применение для изучения активных центров ферментов и белково-нуклеиновых комплексов [І, 77] Как известно, основными факторами, определяющими фотохимическое поведение арилазидов, являются, во-первых, собственно природа арилазидного остатка (наличие и положение заместителей в ароматическом кольце), во-вторых, условия проведения фотолиза (растворитель, температура, интенсивность света при облучении) [78-82] Введение заместителей в ароматическое кольцо арилазида приводит к изменению фотохимических свойств арилазидного остатка В настоящем разделе обзора основное внимание будет уделено фотохимическим свойствам фотореагентов на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильного остатка (в связи с его широким использованием), а также сравнению этих фотореагентов с некоторыми другими Наличие атомов фтора в арилазиде приводит к увеличению времени жизни синпетного нитрена в 170-1700 раз по сравнению с фенилазидом [83-85] Синглетный перфторарилнитрен представляет собой активную электрофильную частицу и способен образовывать ковалентные аддукты с бензолом и даже с циклопентаном [78, 83, 84]. Для триплетного нитрена, образующегося в процессе фотопревращения ароматической азидогруппы, также показано, что электрон-акцепторные заместители увеличивают его реакционную способность [В6] Для изучения механизма фотолиза пентафторазидобензола (13) авторы [87] облучали его в толуоле На схеме 21 представлены продукты фотопревращения соединения (13) На первой стадии фотолиза пентафторазидобензола (13) происходит образование синглетного нитрена (14), который может расходоваться по двум различным направлениям, путем интеркомбинационного перехода (ИКП) превращаться в триплетный нитрен (15) или, претерпевая внутримолекулярную перестройку, переходить в перфторбензазирин (16) и далее в перфторазациклогептатетраен (17). Триплетный нитрен (15) либо димеризуется с образованием азосоединения (18), либо, окисляя компоненты раствора, превращается в перфторанилин (19). При взаимодействии триплетного нитрена (15) с толуолом происходит отрыв водорода от метильной группы толуола с образованием радикальной пары (20) которая превращается в продукт (21) в результате рекомбинации (схема 22).
Радикальную пару Взаимодействие синглетного нитрена (14) с толуолом происходит по реакции внедрения по С-Н связям ароматического кольца с образованием набора изомеров (22) Механизм взаимодействия перфторфенилнитрена с ароматическими соединениями был изучен при фотолизе пентафторфенилазида (13) в бензоле при 0 С [78, 84] Наряду с образованием пентафторанилшга (19) (продукт триплетного нитрена (15), выход 5 %), авторы наблюдали образование соединения (23) - продукта внедрения синглетного нитрена (14) по С-Н связи бензола, выход 46 % Следует отметить, что образование соединения (23) происходит в темновой стадии, а его предшественником (24) является продукт взаимодействия синглетного нитрена (14) с бензолом по реакции Дильса-Альдера [Щ (схема 23) Фотолиз соединения (13) при 25 С в толуоле приводил к образованию перфторанилина (19) {12 %), соединения (21) и набора изомеров (22) (52 % для (21) и (22)) С учетом задач, решаемых с помощью фотоаффинных реагентов, аддукты (21) и (22) представляют наибольший интерес В данном случе, в результате фотомодификации биологических объектов будут образовываться желаемые стабильные продукты со структурой аналогичной соединениям (21) и (22) В отличие от фторзамещенного арилазида фенилазид при облучении в толуоле дает только следовые количества продуктов реакции с растворителем [78, 83]. В ходе облучения метилового эфира 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойнои кислоты (25) в толуоле при 15 С продукт реакции триплетного нитрена - метиловый эфир 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты (26) был зафиксирован только в следовых количествах [83] (схема 24) Продукты внедрения синглетного нитрена в С-Н связь ароматического кольца толуола (27) и продукт радикального замещения по метильной группе толуола (28) образовывались с выходом 28 % и 12 %, соответственно (схема 24) Остальным продуктом (около 60 %) являлась смола, образующаяся при полимеризации соответствующего белзазирина Из вышеприведенных данных видно, что наличие сложноэфирной группировки в пира-положении к азидогруппе приводит к уменьшению количества прод ктов триплетного и к увеличению - синглетного нитренов В работе [89] авторы показали, что для эфиров, тиозфиров и амидов синглетных нитренов 2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты константы скорости реакции с 7 —1 —I пиридином одинаковы и равны З 1 х 10 М с Так же равны суммы констант скорости ИКП и реакции образования азациклогептатетраена (4 8 х 106 с"1) Из этих данных можно сделать вывод о том, что тип связи при присоединении линкера (амидный или эфирный) не оказывает существенного влияния на реакционную способность перфторарилнитренов Для исследования влияния лярл-заместителя в перфторфенилазидах на реакционную способность фотогенерируемых из них нитренов авторы [90] синтезировли фотореагенты на основе я-азидотетрафторбензальдоксима (33) и п-азидотетрафторбензальгидразона (34) (схема 27) Степень фотомодификации ДНК-мишени олигонуклеотидными производными азидов (25), (33), (34) составила 69 % [9IJ, 57 % [92] и 33 % [93] соответственно Эти данные показывают, что фотореагенты на основе соединений (33) и (34), имеющие двойную связь в шрд-положении к азидогруппе, тоже перспективны для фотоаффинного мечения биополимеров С точки зрения фотоаффинного мечения биополимеров интерес представляют не только константы скорости реакции синглетных нитренов, но и структура образующихся продуктов, поскольку их химические свойства помогают оценить стабильность фотосшивки К сожалению, в цитируемых работах структура фотопродуктов определена для ограниченного ряда органических соединений, имитирующих функциональные группы аминокислот
К вышеупомянутым установленным продуктам реакции перфторарилнитрена с бензолом и толуолом, имитирующим боковые заместители ароматических аминокислот, можно добавить только структуру сульфенамида (39) Продукт (39) образуется при фотовзаимодействии соединения (25) с диметилсульфидом, имитирующим остаток четионина (схема 29). Следует отметить, что при использовании других азидов на основе метилового эфира бензойной кислоты с меньшим количеством атомов фтора авторам не удалось выделить устойчивых продуктов с диметилсульфидом Для понимания влияния заместителей на продукты реакции перфторазндов необходимо рассмотреть механизм перехода нитрена из синглетного состояния в триплетное Синглетныи нитрея может превратиться в триплетный путем ИКП (схема 30) Высокая разница в энергии (35 ккал/моль [97]) между синглетным и триплетным состояниями понижает скорость такого перехода [98] В арилкарбене - аналоге арилнитрена по электронной конфигурации, разница в энергии между состояниями составляет 9 ккал/моль [99], что существенно увеличивает скорость ИКП (кжп Ю9"10 с-1) [100] ИКП как для арилкарбена, так и для арилнитрена происходит по механизму спин-орбитального взаимодействия (СОВ) из ст"-кон фигурации синглетного нитрена в тршпетный (ак), при этом переход электрона сопровождается как изменением орбитального углового момента, так и инверсией спина [101, 102] Однако, для синглетного нитрена, в отличие от карбена, более энергетически выгодной является внутренняя конверсия (ВК) из о -конфигурации в стя-конфигурацию [103, 104]. ИКП из ал-конфигурации синглетного нитрена в триплетный Затг происходит медленно, что и обеспечивает продолжительное (относительно карбена) существование синглетного нитрена [101, 102] По мнению авторов [89] наличие заместителя с неподеленной электронной парой в ля/?а-положении перфторбензольного кольца стабилизир ет о2-конфигурацию синглетного нитрена, что приводит к снижению ВК и, как следствие, к увеличению скорости ИКП-СОВ Сравнение скорости ИКП для пентафторфенилнитрена (икп 3 х Ю7 с-1) и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты iV-метиламида (36) (Икп 3 х 10 с") показывает, что наличие замещенной карбонильной группы в лорд-положении уменьшает скорость ИКП в 10 раз [105]
Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковыми радикалами аминокислот в составе комплементарного комплекса
Настоящий раздел посвящен сравнению эффективности модификации функциональных групп биополимеров широко используемыми в настоящее время реагентами на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты Под эффективностью модификации в дальнейшем будет пониматься способность реагента обеспечивать образование определенного процента ковалентных аддуктов с исследуемым объектом. Для сравнительного анализа взаимодействия арилазидных производных олигонуклеотидов с функциональными группами нуклеиновых кислот и белков мы сконструировали специальную модельную систему Модель состоит из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, одно из которых является реагентом, а другое - мишенью модификации У реагента к 5 -кониевому фосфату через спейсер присоединена арилазидная группа У мишени к З -концевому фосфату олигонуклеотида через спейсер присоединен боковой радикал аминокислоты Образование комплементарного комплекса позволяет сблизить фрагмент аминокислоты с арилазидным остатком на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков. В качестве мишеней для фотомодификации в работе использовали остатки соединений, моделирующих боковые радикалы цистина, лизина и триптофана -цистамин, пропилендиамин и 3-индолилуксусную кислоту, соответственно Для присоединения фрагментов аминокислот в работе использовали олигонуклеотид GGTATCp (71), а в качестве носителя фотоактивируемой группы - pGATACCAA (72) (схема 44) Выбор в качестве мишеней модификации соединений с алифатической аминогруппой или боковым радикалом триптофана обусловлен тем, что при фотоаффинной модификации белков эти центры являются наиболее предпочтительным местом атаки арилазидными реагентами [1]. Более того, как было отмечено в главе 1 «Литературный обзор», именно в реакции синглетного перфторарилнитрена с индолом достигается максимальное абсолютное значение константы скорости бимолекулярной реакции [96] (см. табл 4).
Для изучения свойств 0-фосфорилметилендиметилиминиевых производных моно-и олигонуклеотидов нами был осуществлен синтез и выделение из реакционной среды реакционноспособного производного тимидин-5 -фосфата (77а) и производного ряда олигодезоксирибонуклеотидов pGTG (776), GGTATCp (77в), pGATACCAA (77г), pAATGCCAA (77д), pTGATAC (77e), pATGA (77ж) Реакционные смеси, содержащие цетшприметиламмониевые соли мононуклеотида или олигонуклеотида (в разных экспериментах от 0 01 до 1 мкмоль), 150 мкмоль Ph3P/(PyS)2 в 1 мл DMF выдерживали в течение 15 мин при 20 С, после чего производное нуклеиновой кислоты осаждали 15 мл 2 %-ного раствора LiC!04 в ацетоне Осадок промывали ацетоном, эфиром На рис 14 приведен спектр 3Р-ЯМР фосфорилирующего производного олигонуклеотида pd(GTG) (776) в DiO, спустя 6 мин после выделения из реакционной смеси В спектре регистрируется сигнал ядер фосфора межнуклеотидной фосфатной группы (5 = -0 81 м д.) и сигнал при -1 74 м д. С течением времени интенсивность сигнала при -I 74 м д уменьшается и через 20 ч он перестает регистрироваться В то же время появляется сигнал при 3 95, соответствующий, как было показано путем добавления исходного олигонуклеотида pd(GTG), сигналу незамещенного концевого фосфата, и сложный сигнал в области, характерной для пирофосфатов [138] с центром при -14 2 м д Анализ продуктов методом ИОХ согласуется с предположением, что в ходе гидролиза образуется исходный олигонуклеотид и циклический пирофосфат, который может получаться в результате внутримолекулярного фосфорилирования одного из двух межнуклеотидных фосфатов в pd(GTG) Время удерживания основного продукта гидролиза на анионообменной смоле совпадает со временем удерживания исходного олигонуклеотида Наличие свободного концевого фосфата в продукте дополнительно подтверждено гидролизом фосфомоноэфира в реакции, катализируемой щелочной фосфатазой. Время удерживания другого продукта на анионообменной смоле уменьшается в соответствии с изменением суммарного заряда исходного олигонуклеотида на +2, как и следует ожидать для циклического пирофосфата. На рис 15 приведен спектр Н-ЯМР реакционной смеси, образующейся при гидролизе активированного производного рТ (77а) Из спектра видно, что вблизи от сигнала протона тимидина Н-6 (5 = 7 75 м. д) присутствует синглетный сигнал (8 = 7 99 м. д), характерный для атома Н DMF [153]. Отношение интенсивностей этих двух сигналов примерно 1 1. В области сигналов метильных групп обнаруживаются два сигнала с 5 = 2.90 м. д и 5 = 3 05 м д, характерные для метильных групп DMF (5 = 2,79 м. д и 5 = 2,94 м. д для 100 %-ного DMF [153]) Эти сигналы не регистрируются в контрольном образце рТ, выделенном из DMF по схеме, аналогичной для выделения активированного производного мононуклеотида (77а) Это дает основание считать, что появление DMF в реакционной смеси связано с его образованием в ходе гидролиза производного рТ. Отсюда следует, что остаток DMF входит в активированное производное мононуклеотида (77а). В работе [І54] на роль активированного производного рТ постулировалась фосфорилоксифосфониевая соль (РазР -О-РС -СЖ) (см схему 46) Как показали наши исследования, область от 7 2 м д до 8 5 м д Н-ЯМР-спектра, в которой должны регистрироваться чультиплетные сигналы протонов от аро\гатических остатков PIrjPO и тиопиридина, свободна от дополнительных сигналов
Следовательно, соединение (77а) не содержит фрагментов ни одного из компонентов окислительно-восстановительной пары Ph3P/(PyS)2 и не является фосфорилоксифосфонпевой солью Авторши работы [73], было показано, что DMF реагирует с диэтилхлорфосфатом с образованием имидоилфосфата (схема 19), который достаточно стабилен в отсутствие влаги и в то же время в присутствии оснований реагирует со спиртами, аминами и эфирами фосфорной кислоты с образованием соответствующих эфиров, амидов и пирофосфатов Добавление к активированному олигонуклеотиду d{GGTATC)p (77в) О 5 М водных растворов аминов (1,3-диаминопропана, цистамина), приводит в течение нескольких минут к практически количественному превращению его в соответствующие амидофосфаты - (74), (76) на что указывают данные ЛР-ЯМР спектроскопии В 3Р-ЯМР спектрах соединений (74), (76) регистрируются сигналы ядер атомов фосфора межнуклеотидной фосфатной группы (б -2 м д ) и сигнал (5 т8 ч д) в области, характерной для алифатических амидофосфатов [138] Аналогичные превращения наблюдаются при фосфорилировании 1,3-диа.чинопропана активированным олигонуклеотидом pGATACCAA (72) Масс-спектрометрический анализ производного (76) подтверждает присутствие в олигонуклеотидном производном остатка цистамина. На спектре исходного олигонуклеотида регистрировался пик с массой 1887 65, что соответствует структуре d(GGTATC)p, а спектр основного пика производного олигонуклеотида соответствовал массе 2021 88, что согласуется со структурой d(GGTATC)p-NH(CH2)2SS(CH2)2NH2 Фотоактивируемое производное олигонуклеотида (72) получали путем бензоилирования аминогруппы 1,3-диаминопропанового спейсера, присоединенного к олигонуклеотиду (72), с помощью jV-оксисукцинимидного эфира 4-азидо-2 3,5,6-тетрафторбензойной кислоты Целевой продукт реакции выделяли обращено-фазовой хроматографией (см. главу 3 «Экспериментальная часть») Производное олигонуклеотида (73) индивидуально по данным ионообменной и высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии В ИК-спектре соединения (73) наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2240 см"1. Производное олигонуклеотида, несущее боковой радикал триптофана (75), получали ацилированием с помощью пентафторфенилового эфира 3-индолнлуксусной кислоты алифатической аминогруппы, предварительно введеной в олигонуклеотид (71) Целевой продукт реакции выделяли хроматографией на смоле с обращенной фазой (см главу 3 «Экспериментальная часть»)
Компьютерное моделирование модельных соединений (80) - (82)
Расчет пространственной структуры соединений (80) - (82) проводили методом ограниченной молекулярной механики и динамики по программе Amber 4.0 [166]. Визуализация структур и вращение относительно химических связей проведены с помощью программы HyperChem (HyperCube). Все расчеты осуществлялись на персональных компьютерах типа Celeron 3.3. Синтез л-азидофенилфосфата по методике [2]. л-Нитрофенилфосфат (0 5 г, 1 35 ммоль) восстановленый водородом над катализатором (Pd/C) до я-аминофенилфасфата любезно предоставлен Т.М, Ивановой. К полученному водному раствору (1 мл) и-аминофенилфосфата (1 35 ммоль) добавляли 5 мл 1 М раствора НС1 Реакционную смесь охлаждали льдом с солью до -10 С, а затем, при постоянном перемешивании, порциями по 100 мкл, добавляли 0 5 мл водного расвора NaNd (0 2 г, 3 ммоля) Последующие процедуры проводили в темноте Выдерживали 10-15 мин при температуре 0 С, после чего, не прекращая перемешивания, порциями по 100 мкл, добавляли 1 мл водного расвора NaN3 (0,9 г, 14 ммоль) Выдерживали 30 мин при температуре 0 —3 С Реакционную смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты (2 х 10 мл) Водную фракцию концентрировали на вакуумном ротационном испарителе Очистку л-азидофенилфосфата проводили перекристаллизацией из этанола. Выход продукта составил 80 % (0.4 г) по отношению к исходному соединению Вещество гомогенно по данным ТСХ R/= 0 59 (система А). ИК-спектре наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2130 см"1 Спектр !Н-ЯМР (D O, 5, м д) 7 29 (д, 2Н, Нг, Н6 ; Jr;y = Jy,6" = 90 Гц), 7.14 (д, 2Н, Н3», Ну J2»,r =Jy,6-= 9.0 Гц). 3.4. Синтез р-(4-аз идо фенил )уридин-5 -дифосфата (63), Навеску динатриевой соли 4-азидофенилфосфата (9 I мг, 35 мкмоль) суспендировали в ацетонитриле (140 мкл), добавляли Et]N (73.5 мкл, 525 мкмоль) и при перемешивании и охлаждении во льду приливали TFA (73 5 мкл, 525 мкмоль) Смесь желтела осадок NjPhOPC Naj растворялся в течении 7-10 мин. Полученный прозрачный раствор упаривали в вакууме, впускали сухой воздух. К остатку добавляли смесь Melm (8.4 мкл, 105 мкмоль) и Et3N (24.5 мкл, 105 мкмоль) в ацетонитриле (70 мкл), выдерживали 3 мин и приливали к UMP»EtjN (140 мкмоль). После выдерживания 30 мин к реакционной смеси добавляли DMSO-d , регистрировали Р-ЯМР спектр По данным интегральной интенсивности сигналов спектра, степень превращения 4-азидофенилфосфата в (3-(4-азидофенил)уридин-5 -дифосфат составляла 28 %.
Целевой продукт реакции выделяли в темноте методом ионообменной гель-фильтрации на колонке 1.8 х 20 см со смолой DEAE Sephadex-A25-120 (Sigma, США) в гидрокарбонатной форме. В качестве элюента использовали Et3NH+HCOj" (0.05 - 0.5 М, рН = 7.0). ИК-спектре наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2130 см"1 Спектр Н-ЯМР (ОгО, 5, м. д.): 7 68 (д, IН, Н6, Ju = 8 5 Гц), 7.30 (д, 2Н, Н2 -, Н6«, J2 -, r = Jy\ 6- = 90 Гц), 7.16 (д, 2Н, Hr, Hs- Jr\з» = Jy\6- = 90 Гц), 5.69 (д, 1Н, Н5, J}6 = 8 5 Гц), 5,94 (д, 1Н, Нг, J, 2 = 4 5 Гц), 4.19-4 30 (м, 5Н, Н2-, Ну, НА- И Н5). Э1Р-ЯМР (D20, 6, м д )" -10 4 (д, IP, Л, ./л,га = 17 б ГЦ), -15 3 (д, 1Р, Р2, JP]F1=\16 Гц) 3.5. Фотолиз «-азидофенилфосфата в карбонатном буферном растворе (рН = 9.6). Раствор я-азшюфенилфосфата (0 317 х 10"3 М) в карбонатном буфере (рН = 9.6) помещали в кварцевую кювету (0.1 см) и облучали светом ртутной лампы через комбинацию фильтров УФС-2, ЖС-3 (X = 313), в течение 14 мин. За ходом реакции следили путем записи электронных спектров поглощения Превращение и-азидофенилфосфата в л-бензохинонмоноимин практически количественное UV-Vis, тш нм (log є) 254 и 261 (4.38) {лит. Хтах, 253 5 (log є 4.38) и Хтах, 260 (log є 4.39) для /z-бензохинонмоноимина в буфере рН 8 [143]}; Н-ЯМР (CDCb, 5, м д.): 10.77 (м, H-N=), 7 27 (д, Нз,У;j = 10 2 Гц), 6.76 (д, Н5, JS6 = 9 4 Гц), 6.62 (д, H2J J= 10 2 Гц), 6.46 (д, Н6, 4 = 9.4 Гц) 3.6. Выделение продуктов фотолитического разложения л-азидофен ил фосфата в водном растворе (рН = 5.1). Раствор л-азидофенилфосфата (0.34 х I0"3 М) в D2O (0.4 мл) помещали в кварцевую кювету (0 1 см) и облучали светом ртутной лампы через комбинацию фильтров УФС-2, ЖС-3 {X = 313), в течение 26 мин. Гидрофобный продукт фотолиза экстрагировали CDCb (2x03 мл) Продукт хлороформной фракции анализировали методами !Н, 13С-ЯМР-спектроскопии, Н ЯМР (CDCb, 5, м д.): 6.89 (с, 4Н); "С-ЯМР (CDCb, 5, мд): 187 1 (с, С!, С4), 136 45 (с, С2, СЗ, С5, Сб) - п-бензохинон Продукт водной фракции анализировали методом 31Р-ЯМР-спектроскопии 31Р-ЯМР (D20,5, н д.): 0 27 (с, IP) - фосфат ион. 3.7. Фотолиз л-азидофенилфосфата в присутствии лизина при рН 9.6. Для получения I М раствора лизина навеску монохлоргидрата аминокислоты (54.1 мг) растворяли в 0.05 М (рН 9.6) карбонатном буфере (0 5 мл) К раствору аминокислоты (0.475 мл) добавляли 25 мкл водного раствора н-азидофенилфосфата (6.28 х \0 г М). Полученный раствор помещали в кварцевую кювету и облучали светом ртутной лампы через комбинацию фильтров УФС-2, ЖС-3 (X = 313), в течение 14 мин. За ходом реакции следили путем записи электронных спектров поглощения. Продукт реакции анализировали методом 31Р-ЯМР спектроскопии. 31Р-ЯМР (ОгО, б, м. д.): 9,37 (с, IP)-алифатическийамидофосфат. 3.8. Синтез я-бензохинонмоноимина при рН 9.6. л-Бензохинонмоноимин получали из л-аминофенола окислением последнего оксидом серебра. Свежеперекристаллизованный из метанола л-аминофенол (1.1 мг) в 0 5 мл карбонатного буфера (0 05 М, рН 9.59) окисляли избытком свежеосажденного оксида серебра. Осадок отделяли центрифугированием.
Водный раствор анализировали методом электронной спектроскопии, UV-Vis, Я.тм, нм (log є, М" см" ): 254 и 261 нм, (4 38), Продукт реакции - я-бензохинонмоноимин экстрагировали из воды CDCh (2 х 0.3 мл) Спектр Н ЯМР (CDCb, 5, м д). 10.77 (м, H-N=), 7 27 (д, Н3, J2i = 10 2 Гц), 6 16 (д, Hs, J 6 = 9 4 Гц), 6 62 (д, Нг, h з = 10 2 Гц), 6.46 (д, Н6, h б = 9 4 Гц). 3.9. Фотолиз я-азидофенилфосфата в водном растворе 2,6-ксилола. Водный раствор (0 160 мл) «-азидофенилфосфата (0 34 х 103 М) и 2,6-ксилола (2 6 х 10 3 М) облучали в кварцевой кювете толщиной 0 1 см в течение 80 с За ходом реакции следили путем записи спектров поглощения Бесцветный раствор становился фиолетовым (Xma.t = 486 нм). После прекращения изменений в UV-Vis спектрах продукт фотореакции экстрагировали серным эфиром (2 х 0,5 мл) Окрашенную в оранжевый цвет (Хтах = 477 нм) органическую фазу отделяли, добавляли 1 мл 0.01 М раствора КОН. Окрашенный в синий цвет (ктзх = 595 нм) щелочной экстракт упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в минимальном количестве D;jO, упаривали, растворяли в 500 мкл D2O UV-Vis спектр (D2O, рН 12), А.тах, нм (log е): 595 (4 23) Спектр Н-ЯМР (D20,5, м д) 7.17 (с, 2Н, Н2 , Не-), 7 00 (д, Н3, HS) 2Н, J = 8.2 Гц), 6 63 (д, 2Н, Н2, Не, J 8.2 Гц), 2.04 (с, 6Н, -СН3) - 3 ,5 -диметилиндофенол 3.10. Получение цетавлоновой соли олигонуклеотидов. К 10 ОЕгбо литиевой соли олигонуклеотида в 10 мкл воды добавляли порциями по 2 мкл 8 % раствор /V-цетил-ЛДД-триметиламмоний бромида (цетавлона) в воде до прекращения выпадения осадка Осадок собирали центрифугированием, промывали серным эфиром (3 х 1 мл). 3.11. Получение фосфорилирующих производных моно- и олгонуклеотидов (77а) - (77ж) в DMF. Реакционную смесь, содержащую цетавлоновую соль рТ или олигонуклеотида (в разных экспериментах от 0.01 до 1 мкмоль), 150 мкмоль (39.3 мг) PbjP и 150 мкмоль (33 мг) (PyS)2 в 1 мл выдерживали в течение 15 мин при 20 С, после чего активное производное моно- или олигонуклеотида осаждали 15 мл 2 % раствора L1CIO4 в ацетоне. Осадок собирали центрифугированием, промывали ацетоном и эфиром (по 15 мл). 3.12. Синтез 3 -(3-аминопропил)-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp (74). Реакционную смесь, содержащую 5 ОЕгео цетавлоновой соли олигонуклеотида, 15 мкмоль (3.93 мг) РЬзР, 15 мкмоль (3 3 мг) (PyS); в 0.095 мл DMF, инкубировали 15 мин при 20 С, после чего фосфорилирующее производное олигонуклеотида осаждали 1 мл 2 % раствора LiClO в ацетоне. Осадок промывали ацетоном и эфиром (по 1 мл), добавляли 100 мкл 0 5 М раствора 1,3-диаминопропана в НгО, выдерживали І ч при 20 С, пропилендиаминовое производное олигонуклеотида выделяли ОФХ. Степень превращения по данным ИОХ составляла 93 %. 31Р ЯМР (D20, 5, м д ) 8 4 (с, IP), -2.0 (м, 5Р) 3.13. Синтез 3 -(3-аминопропил)-амидофосфата олигонуклеотида pGATACCAA.
Синтез Д/'-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-зтил}-4- азидо-2,3,5,б-тетрафторбензамида(80)
Внутридуплексная фотохимическая модификация. Образцы (24 мкл), содержащие 5 -згР-меченый олигонуклеотид (71) или его производные, несущие функциональные группы аминокислот (соединения (74) - (76) в концентрации I0"5 М и арилазидное производное олигонуклеотида (73) в концентрации 10" М в фосфатном буфере {рН 8 9), помещали в лунки планшета, охлаждали до 4 С и облучали светом ртутной лампы с расстояния 15 см Время экспозиции 6 мин. После облучения реакционную смесь выдерживали в течение ночи при 4 С в темноте и анализировали с помощью гель-электрофореза в 20 % полиакриламидном геле (8 М мочевина, 0.05 М Трис-борат (рН 8 3), 1 мМ EDTA) или анионообменной хроматографией в денатурирующих условиях (градиент - 0 - 1 М NaCl в 0 01 М КН2РО4 (рН 8 9) в присутствии 7 М мочевины) Распределение вещества в дорожках геля определяли по денситометрическим профилям радиоавтографа. После хроматографического разделения реакционной смеси для количественной оценки выхода продуктов фотомодификации просчитывали по Черенкову радиоактивность соответствующих фракций. Степень модификации (%) определяли как отношение площади пиков, соответствующих продуктам модификации, к суммарной площади всех пиков (%). 3.18. Синтез трет-бутилоксикарбониламино-(4-пірет-бутилкарбонилоксибензил)-уксусной кислоты (98). К раствору тирозина в 8 М КОН (водный раствор, 1.66 ммоль, 4.2 мл) добавляем раствор (Вос)гО в i-Pro-OH (4 47 ммоль, 2.5 мл). Реакцию проводили при постоянном перемешивании в течении 4 ч. После завершения реакции добавляли 5 мл воды, продукты экстрагировали диэтиловым эфиром (5 х 10 мл). Эфирную фракцию промывали КОН (водный раствор, 1 М, 10 мл). К объединенным водным фракциям добавляли НС1 (водный раствор, 5 М) до значения рН = 2-3. Продукт из водного раствора экстрагировали этилацетатом (3 х 10 мл). Этилацетат упаривали досуха, образовавшееся масло кристаллизовали, растирая с 10 мл гексана.
Выход 55 %. 3.19. Синтез уУ-гидроксисукцинимидного эфира /яре/н-бутилоксикарбониламино-(4-шреш-бутилкарбонилоксибензил)-уксусной кислоты (99). К раствору соединения (98) в дихлорметане (0.92 ммоль, 10 мл) последовательно добавляли Suc-OH (1.1 ммоль) и DCC (1.1 ммоль). Реакционную смесь выдерживали в течение 8 ч, фильтровали от осадка, супернатант упаривали досуха. Получившееся масло растворяли вдиэтиловом эфире, эфир упаривали Выход 90 %. 3.20. Синтез Л"-(3-аминопропил)-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (100). К раствору 1,3-диашшопропана в этилацетате (700 мкмоль, 500 мкл) добавляли по каплям раствор Лг-гидроксисукцинимидного эфира 4-азидо-2,3,5,6-фторбензойной кислоты в этилацетате (100 мкмоль, 400 мкл) при постоянном перемешивании. Выдерживали в течение 20 мин. Этилацетат упаривали, сухой остаток растворяли в 50 мкл метанола Затем добавляли 30 мкл раствора хлороводорода в метаноле (6 М) и осаждали продукт диэтиловым эфиром в виде хлор гидрата Выход 72 %, Л/0.2 (система В) 3.21. Синтез Л"-(2-аминоэтил)-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (101). Аналогично синтезу соединения (100), Выход 64 %, R/0.17 (система В) 3.22. Синтез Лг-(4-аминобутил)-4-азидо-2,3,5,б-тетрафтор-бензамида (102). Аналогично синтезу соединения (100). Выход 69 %, Д/0.21 (система В) 3.23. Синтез Лг-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-этил}-4-азидо- 2,3,5,6-тетрафторбензамида (80). К раствору соединения (101) в дихлорметане (50 мкмоль, 400 мкл) добавляли соединение (98) (60 мкмоль) и Et3N (60 мкмоль). К полученной взвеси добавляли DCC (60 мкмоль). Реакционную смесь выдерживали в темноте при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Выпавшую в осадок дициклогексилмочевину отделяли центрифугированием, растворитель упаривали. Сухой остаток растворяли в этилацетате и промывали по очереди 1 М НС1 (2 х 200 мкл), 0 1 М КОН (2 х 200 мкл), водой (2 х 200 мкл). Растворитель упаривали. Снятие бутилоксикарбонильной защиты проводили муравьиной кислотой согласно методике [167]. Выход 82 %. Я/0.74 (система В) УФ-спектр (Н20), \т&, нм (lg є): 223 (3.91), 263 (4.36). В ИК-спектре наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2240 см"1. Спектр Н-ЯМР (CD3CN, 8, м.д.): 7.18 (д, 2Н, Н2», Н6», Jrx = 69 Гц), 6.88 (д, 2Н, Ну, Н3», Jr,i" = 6.9 Гц), 4.60-4.67 (м, 1Н, Н5), 3.70-3.87 (м, 2Н, Н7»), 3.30- 3.60 (м, 4Н, Нз, Н4). Спектр !9Р-ЯМР (CD3CN, 8, м д.): 12.6 (м, 2F, Fy, F5-), 21 б (м, 2F, Vr, F6.). MALDI-масс: m/z 429.2 [M -N2 + H3]\ рассчитано для С19Н2Р4К403 429.155. 3.24. Синтез Л"-{3-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-пропил}-4- азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (81). Аналогично синтезу соединения (80) Выход 63 %, Rf 0.7 (система В) УФ-спектр (Н20), Х , нм (lg є): 223 (3.91), 263 (4 36). В ИК- спектре наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2240 см-1. Спектр Н-ЯМР (DMSO-ds, 8, м.д.): 6.97 (д, 2Н, Н2», Н6», Jry = Л" г = 8.4 Гц), 6.66 (д, 2H, Нг, Из-, Jy2" = Jb -.6- = 8.4 Гц), 3 48 (т, Ш, Н8,У8,Г = 69 Гц), 3 02-3.17 (м, 4Н, Н3, Hj), 2 71-2.79 (м, 2Н, Н7-), 1-51-1 60 (м, 2Н, Н4). Спектр !9Р-ЯМР (DMSO-d6, б, м.д.): 15 5 (м, 2F, F3-, Fj-), 24.2 (м, 2F, Fr, F6-)- MALDI-масс: m/z 429.2 [M - N2 + H3]+, рассчитано для CIJHJIF CV 429 155. 3.25. Синтез ;У-{4-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-бутил}-4-азидо- 2,3,5,6-тетрафторбензамида (82). Аналогично синтезу соединения (80) Выход 48 %, Щ 0 67 (система В). УФ-спектр (Н20), Хтзх, нм (lg є): 223 (3 91), 263 (4 36) В ИК-спектре наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2240 см"1. Спектр 1Н-ЯМР (DMSO-d6, 5, м д), 8 90 (м, 2Н, Н2, Н7), 6.98 (д, 2Н, Hr, Hs, Jv x = 8.4 Гц), 6.70 (д, 2Н, Нз-, Hr, Jr,r = 8 4 Гц), 3 36 (дд, IH, Н9, JT%9= 7.8, J7"a,9=5 5 Гц), 3 00-3.12 (м, 4Н, Нз, Н6), 2 80 (дд, IH, Hr-a Л ъ/гр = 13.5 Гц, J7. a,9 = 5.5 Гц), 2.55 (дд, IH, Нгр, J7 0,ra = 13.5, У7"р.9 = 7 8 Гц), 1.40-1 44 (м, 4Н, Н4, Н5) Спектр 19Р-ЯМР (DMSO-d6 5, м д, J, Гц): 19.5 (дд, 2F, F3-, Fy, Jy? = 21.7 Гц, Jrfi.= 9.1 Гц), 27.9 (дд, 2F, F2-, F6-, Jrj = 21.7 Гц, Jr,r = 9 1 Гц) MALDI-масс m/z 443.2 [M - N2 + H3]+, рассчитано для C2oH23F4N403+443.171 3.26.
Синтез Лг-{3-[2-амино-3-(1Я-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-4-азидо- 2,3,5,6-тетрафторбензамида (83). К раствору триэтиламина в этилацетате (32 мкмоль, 250 мкл) последовательно добавляли соединение (100) (30.5 мкмоль) и соединение (97) (32 мкмоль) Реакционную смесь выдерживали в темноте при постоянном перемешивании в течение 12 ч. Растворитель упаривали досуха, продукт промывали водой (3 х 500 мкл). Выход 95 %, R/0 99 (система В). Снятие бутилоксикарбонильной защиты проводили согласно методике [167]. Выход 97 %, Л/0 71 (система В), УФ- спектр (Н20), w нм (lg є)" 220 (4.53), 263 (4.36), 290 (3.66). В ИК-спектре наблюдается характерная для азидогруппы полоса поглощения при 2240 см"1. Спектр Н-ЯМР(О20,6,мд):7.68(д, Ш, Нг, У5"б"=8.1 Гц), 7.57 (д, IH, Hg», У8",г-= 8.1 Гц), 7.39 (с, 1Н, Нг), 7.30 (т, IН, Hr, Jr- 6» = У7".г = 8-1 Гц), 7 23 (т, IН, Н6", Jr;r = Л",г = 8 I Гц), 4 26 (т, IH, Не, Лю- = 5.9 Гц), 3.45 (м, 2Н, Н1(Г), 3.26 (м, IH, HJa), 3.05 (м, Ш, Hjp), 3 00 (т, 2Н, Нэ, J3A = 7.0 Гц) 1.47 (м, 2Н, Н«). Спектр 19Р-ЯМР (D20, 5, мл): 14.2 (м, 2F, F3-, Fj-), 22.9 (м, 2F, F2-, F6 ). MALDI-масс: m/z 451.9 [M - N2 + H3]+, рассчитано для C2H22F4N502+452.171 3.27. Идентификация основных продуктов фотолиза соединений (80), (81), (82), (84) Соединение (84). УФ-спектр (Н20), Хтах, нм: 258. Спектр Н-ЯМР (CD3CN/D20 (1:1, v/v), 5, м.д.): 8.47 (м, 2Н, Н2, Н;), 6.96 (д, 2Н, Нг, Ые, Jr-y = Jy;r = 8.4 Гц), 6.65 (д, 2Н, Н3", Hs., із".г- = Jrjr = 8.4 Гц), 6 22-6 24 (м, ЗН, НА ІН), 3 39 - 3.44 (м, 1Н, Н7), 3 12-3.22 (м, 4Н, Нз, Н»), 2.73-2.58 (м, 2Н, Н7»). Спектр 19Р-ЯМР (CD3CN/D20 (1:1, v/v), 5,мд.): 5.7 (м, 2F, F3 , F3.), 21 4 (м, 2F, Fr, F6-). MALDI-масс: m/z 415.1 [М + Н]+, рассчитано для С]gH tyCV 415 139 Соединение (85). УФ-спектр (Н20), А.тах, нм- 258. Спектр Н-ЯМР (CD3CN/D20 (I: l, v/v), 5, м д.): 8.48 (м, 2Н, Н2, Н6), 6 94 (д, 2Н, Hr, Н6-, J2.y» = У5»6" = 8.4 Гц), 6 64 (д, 2Н, Hj., Hs-, Jy-r = 5",6" = 8 4 Гц), 6 20-6.22 (м, ЗН, Н н), 3 40-3.44 (м, Ш, Н8), 3.08-3.16 (м, 4Н, Нз, Hs), 2.76-2.59 (м, 2Н, Н7»), I 40-1.44 (м, 2Н, Н4). Спектр 19Р-ЯМР (CD3CN/D20 (1-1, v/v), 5, м д.)- 2.6 (м, 2F, F3 , Fs0, 18 6 (м, 2F, F2 , F6.). MALDI-масс m/z 429.2 [M + H]+t рассчитано для C]9H2iF4N403+ 429.155. Соединение (86). УФ-спектр (Н20), 1тлх, нм: 258. Спектр Н-ЯМР (CD3CN/D20 (1:1, v/v), б, м д.): 8.48 (м, 2Н, Н2, Н7), 6 98 (д, 2Н, Н2-, Нб., J2»3» = Jrfi = 8.4 Гц), 6 67 (д, 2Н, Uy, Hs-, Jy-x- = Jr 6" = 8.4 Гц), 6.22-6 24 (м, ЗН, Н ш), 3.39-3.44 (м, 1Н, Н9), 3 00-3.12 (м, 4Н, Нз, Н6), 2.82 (дд, 1Н, Нуа, Jvw$ = 13 5 Гц, Jra,9 = 5.5 Гц), 2.58 (дд, 1Н, Н7 (,, J7»p7»a = 13.5 Гц, У7»р9 = 7 8 Гц), 1.38-1.42 (м, 4Н, Н4, Hj). Спектр 19Р-ЯМР (CD3CN/D20 (1 1, v/v), 5, мд.): 24 0 (д, 2F, Fr, F6-, h\v = 17.8 Гц), 7.9 (д, 2F, у, F5-, Jy? = 17 8) MALDI-масс m/z 443 2 [M + H]+, рассчитано для C2oH23F4N403+ 443.171. Соединение (87). УФ-спектр (H20), Хтах, нм: 254.
![Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола](/i/i/4301/324197.png "Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола Белоглазова Наталья Геннадьевна")
