Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Годовикова Татьяна Сергеевна

Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов
<
Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Годовикова Татьяна Сергеевна. Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов : диссертация ... доктора химических наук : 02.00.10 / Годовикова Татьяна Сергеевна; [Место защиты: Ин-т хим. биологии и фундамент. медицины СО РАН].- Новосибирск, 2007.- 419 с.: ил. РГБ ОД, 71 07-2/124

Содержание к диссертации

СОДЕРЖАНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 10

РАЗДЕЛ 1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ 15

СТРУКТУР МАТРИЧНОГО БИОСИНТЕЗА: ПРОБЛЕМЫ И

ПЕРСПЕКТИВЫ (обзор литературы)

1.1. Подходы к синтезу фотоактивируемых аналогов компонентов 17
надмолекулярных структур матричного биосинтеза для решения задач

по выявлению точек контакта между биополимерами

  1. Ферментативные методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и 22 РНК

  2. Химико-ферментативные методы получения фотоактивируемых 35 фрагментов ДНК и РНК

  3. Химические методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и РНК 43

  4. Роль би- и полифункциональных реагентов в получении специфичных 46 фотоактивируемых белков

  5. Заключение к разделу 1.1. 56

1.2. Структурно-функциональные исследования нуклеопротеидных 57
комплексов рибосом про- и эукариот методом фотоаффинного
сшивания

  1. Рибосомные белки и нуклеотиды рРНК прокариот, сшивающиеся с 58 фотоактивируемыми аналогами мРНК

  2. Расположение мРНК в области декодирования по данным 65 фотоаффинной модификации рибосом человека фотоактивируемыми аналогами мРНК

  3. Пептиды фактора терминации трансляции eRFl, сшивающиеся с 78 фотоактивируемыми аналогами мРНК в составе терминирующих комплексов

  4. Метод «импульсной фотоаффинной сшивки» для исследования 79 динамики взаимодействия тРНК с разными участками рибосомы

  5. Заключение к разделу 1.2. 80

1.3. Фотоаффинная модификация белково-нуклеиновых комплексов 81
матричного биосинтеза нуклеиновых кислот

1.3.1. Некоторые примеры использования метода фотоаффинной 82

модификации биополимеров для структурно-функциональных

исследований РНК-полимераз
1.3.2 Примеры исследования структурно-функциональной организации 86

комплексов репликации и репарации ДНК эукариот методом

фотоаффинной модификации биополимеров
1.3.3. Заключение к разделу 1.3. 93

1.4. Проблемы селективности и эффективности фотоаффинного мечения 95
компонентов надмолекулярных комплексов и пути их решения

  1. Фотоаффинная модификация белков, основанная на синтезе 96 радиоактивного фотоактивируемого реагента in situ

  2. Каталитически компетентное мечение как подход для селективной 99 модификации белково-нуклеиновых комплексов

  3. Применение бинарной системы фотоаффинных реагентов для 105 высокоселективной модификации белков в надмолекулярных комплексах

  4. Влияние строения арилазида на эффективность и селективность 112

фотоаффинной модификации биополимеров реагентами на основе

ароматических азидов
1.5 Заключение к разделу 1 135

РАЗДЕЛ 2. МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 136

РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ С

ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ БЕЛКОВ (результаты и их

обсуждение)

  1. Специфичность и эффективность модификации функциональных 137 групп биополимеров арилазидными реагентами

  2. Фотоиндуцированные реакции арилазидных реагентов в условиях 151 проведения фотоаффинной модификации белков

  1. «Темновые» стадии при фотоаффинной модификации белков 151 реагентами на основе я-азидоанилина и (4-азидофенил)-Л^-алкиламина

  2. Механизмы фотоиндуцированных реакций я-азидофенилфосфата в 157 условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров .

  1. Проблемы, возникающие при интерпретации результатов 157 экспериментов по фотоаффинной модификации белков реагентами на основе л-азидофенилфосфата

  2. Фотохимические превращения и-азидофенилфосфата при его 158 облучении в водных растворах

  3. 3',5'-Диметилиндофенол как продукт фотоиндуцированного 164 взаимодействия л-азидофенилфосфата с 2,6-диметилфенолом

  4. и-Азидофенилфосфат как фотоактивируемый фосфорилирующий 166 реагент

2.2.3. Механизм фотолиза и-нитрозамещенных арилазидов в условиях 169
проведения фотоаффинной модификации биополимеров

  1. Фотоиндуцированные превращения Лг-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3- 170 диаминопропана при его облучении в водных растворах

  2. Фотоиндуцированные превращения 4-нитрофенилазида при его 175 облучении в водных растворах

2.2.4. Фотолиз перфторированного ароматического азида в водном растворе 177
2.3. Разработка общего методического похода к изучению строения 181

продуктов фотоаффинной модификации белков реагентами на основе
ароматических азидов
2.3.1. Фотоиндуцированная аффинная модификация стрептавидина 186

фотоактивируемыми аналогами биотина

  1. Синтез 5-азидо-2-нитро-Лг-{2-[5-(2-оксогексагидротиено[3,4-с1]- 186 имидазол-6-ил)пентаноиламино]-этил}-бензамида, 5-азидо-2-нитро-Л''-{3-[5-(2-оксогексагидротиено[3,4-с1]имидазол-6-ил)пентаноиламино]-пропил}-бензамида и 5-азидо-2-нитро-тУ-{4-[5-(2-оксогексагидро-тиено[3,4-с1]имидазол-6-ил)пентаноил-амино]-бутил}-бензамида

  2. Связывание фотоактивируемых аналогов биотина с лиганд- 187 связывающим центром субъединиц стрептавидина

  3. Фотоиндуцированные превращения фотоактивируемых аналогов 189 биотина при их облучении в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров

  4. Структурный и спектральный анализ продуктов фотоиндуцированного 196 взаимодействия фотоактивируемых аналогов биотина с функциональными группами стрептавидина

2.3.2. Продукты фотоиндуцироанного взаимодействия 207

5-азидо-2-нитробензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реагирующих групп

  1. Синтез ЛЦ2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-зтил}-5- 209 азидо-2-нитробензамида и іУ-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида

  2. Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной 210 группы с боковым радикалом тирозина

  3. Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной 221 группы с боковым радикалом триптофана

2.3.3. Продукты фотовзаимодействия 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной 228

группы с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров

  1. Синтез производных ароматических аминокислот, несущих остаток 228 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты

  2. Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 229 боковым радикалом тирозина

  3. Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 235 боковым радикалом триптофана

РАЗДЕЛ 3. ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ НА 244 ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (результаты и их обсуждение)

3.1. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие арилазидные группы на 246

концевом моноэтерифицированном фосфате, как реагенты для фотоаффинной модификации белков

3.1.1. Синтез арилазидных реагентов - производных 246
олигодезоксирибонуклеотидов - по их терминальной
моноэтерифицированной фосфатной группе

  1. Некоторые аспекты амидирования 5'-концевых 251 моноэтерифицированных фосфатов олигонуклеотидов при использовании трифенилфосфина и 2,2'-дипиридилдисульфида

  2. Фосфорилирующие производные нуклеотидов и олигонуклеотидов с 255 цвиттер-ионной группой как промежуточные соединения при получении арилазидных аффинных реагентов и других амидофосфатов

3.1.2. Фотоиндуцированное взаимодействие арилазидных производных 274
олигонуклеотидов с белками хроматина

3.2. Арилазидные производные нуклеозид-5'-трифосфатов и 279

2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов: синтез и использование в матричном биосинтезе аффинных реагентов - фотоактивируемых производных олиго- и полинуклеотидов

  1. Фотоактивируемые аналоги инициирующего субстрата 280 РНК-полимеразы II на основе арилазидных производных у-амидофосфатов NTP

  2. Арилазидные С-5-аналоги dUTP и UTP: синтез и субстратные свойства 293 в тестах с ДНК- и РНК-полимеразами

  1. Синтез аналогов UTP и dUTP, содержащих остатки ароматических 294 азидов, соединенных с С-5 положением урацила линкерами разного строения

  2. Синтез 5-{Лг-[Л"-(5-азидо-2-нитробензоил)-3-аминопропионил]амино 298 метил}-2'-дезоксиуридин-5'-[сс- Р]-трифосфата

  3. Введение фотоактивируемых групп в нуклеиновые кислоты в процессе 301 матричного биосинтеза в системах с ДНК-полимеразами

  4. Введение фотоактивируемых групп в РНК в процессе матричного 308 биосинтеза в системе с РНК-полимеразой

3.2.3. Разработка подхода, основанного на фотоаффинном мечении, для 310
выявления на метафазных хромосомах в условиях флуоресцентной
гибридизации in situ уникальных ДНК-последовательностей с
помощью зондов-праймеров

3.2.4. Структурно-функциональные исследования репликативного комплекса 319
вируса клещевого энцефалита методом каталитически компетентного
мечения с использованием арилазидных производных UTP
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 324
Материалы и методы 324
Реактивы 324
Методы 327
Методы исследования и методики к разделу 2 330
Конструирование модельного дуплекса и исследование 330
внутрикомплексного фотоиндуцированного взаимодействия
арилазидных групп с функциональными группами биополимеров
Реагенты основе и-азидоанилина и (4-азидофенил)-Лг-алкиламина 335
Реагенты на основе и-азидофенилфосфата 338
Реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты 340
Реагенты на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты 350
Взаимодействие фотоактивируемых аналогов биотина со 354
стрептавидином

Методы исследования и методики к разделу 3 355

Синтез производных олигонуклеотидов 355

Синтез арилазидных производных нуклеозид-5'-трифосфатов для 360
получения фотоактивируемой ДНК и РНК

Флуоресцентная гибридизация in situ 365

Фотоаффинная модификация репликативного комплекса вируса 366
клещевого энцефалита

4.3.5. Фотоиндуцированное взаимодействие арилазидных производных 367
олигонуклеотидов с белками хроматина

ПРИЛОЖЕНИЯ 368

ВЫВОДЫ 371

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 374

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 418

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (ШРАС), Международного Союза биохимиков (ШВ), а также следующие обозначения:

є-ABA-Lys-TPHK- еМ-(азидобензоил)лизил-тРНК ALABdCTP -5-[М-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-т/?анс-3-аминопропенил-1]-

дезоксицитидин-5'-трифосфат
АРЕ 1 -апуриновая/ апиримидиновая эндонуклеаза 1

АРТР - л-азидофенилтиофталимид

ATPyS - аденозин-5'-^-тио-трифосфат

В ATDHP -М-бромацетил-і'- {2,3 -дигидрокси-3 -[3 -(3 -трифторметилдиазирин-3 -

ил)фенил] пропионил} этил ендиамин
BER -эксцизионная репарация основания

Bicine - Л^-бис(2-гидроксиэтилглицин)

Вое - mpem-бутилоксикарбонильная группа

BrdUTP -5-бромдезоксиуридин-5'-трифосфат

CTD -С-концевой домен наибольшей субъединицы РНК полимеразы II

DCC - Л'Д'-дициклогексилкарбодиимид

DMF - А^УУ-диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

dNTP - дезоксинуклеозид-5'-трифосфат

EDC - Л^-(3-диметиламинопропил)-Лг'-этилкарбодиимид

FAB-11-dUTP -5-{Лг-[Л/,-(4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензоил)-6-аминогексаноил]-/ира»с-3-

аминопропенил-1}-3'-дезоксиуридин-5'-трифосфат FAB-13-dUTP -5-{Л/-[Лг-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-8-аминооктаноил]-/иранс-3-

аминопропенил-1 }-3'-дезоксиуридин-5'-трифосфат FAB-4-ddUTP -5-[#-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-транс-3-аминопропенил-1]-2',3'-

дидезоксиуридин-5 '-трифосфат FAB-4-dUTP -5-[Лг-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-транс-3-аминопропенил-1]-3'-

дезоксиуридин-5'-трифосфат FAB-9-dUTP -5-{Л:-[Лр-(4-азидо-2,3,556-тетрафторбензоил)-4-а.минобутирил]-/77ранс-3-аминопропенил-1} -3 '-дезоксиуридин-5 '-трифосфат

FABCdCTP -э\'50-Л^{[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденамино)-оксиметил-

карбониламино]-этил}-дезоксицитидин-5'-трифосфат FABdCTP -эоо-7^-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-этиламино]-

дезоксицитидин-5'-трифосфат FABGdCTP -зя*зо-ІУ-{[4-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденгидразинокарбонил)-

бутил]-карбониламино}-дезоксицитидин-5'-трифосфат FABOdCTP -ЭА:зо-Л^-{[4-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденаминооксибутил)]-

окси} -дезоксицитидин-5 '-трифосфат FAP-7-dUTP -5-{ЛЦ#'-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-2-аминоэтионил]-

транс-3-аминопропенил-1}-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат FAP-8-dUTP -5-{Лг-[Л^'-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]-

транс-Ъ -аминопропенил-1} -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфат
FEN-1 -флэп-эндонуклеаза-1

Gnd.HCl - гуанидиний хлорид

gp -gene product (кодирующие белки репликативного комплекса)

HEPES - Л^-(2-гидроксизтил)-пиперазин-іУ'-(4-бутансульфоновая кислота)

/-РгзРпЗОгСІ - хлорангидрид 2,4,6-триизопропилбензолсульфокислоты
IRES - Internal Ribosomal Entry Site («внутренний сайт посадки рибосомы»)

Mops - 3-(Лг-морфолино)пропансульфоковая кислота

MsCOCl - хлорангидрид 2,4,6-триметилбензойной кислоты МАВ-11^иТР-5-{Лг-[А^'-(2-нитро-5-азидобензоил)-6-аминогексаноил]-транс-3-

аминопропенил-1} -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфат NAB-12-dUTP-5-{ЛL[Л/''-(2-нитpo-5-aзидoбeнзoил)-7-aминoгeптaнoил]-7?фaнc-3-

аминопропенил-1} -2 '-дезоксиуридин-5 '-трифосфат КАВ-13-гїиТР-5-{Л4Л^Ч2-нитро-5-азидобензоил)-8-аминооктаноил]-т;?анс-3-

аминопропенил-1} -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфат NAB-2-dUTP -5-[Л/-(2-нитро-5-азидобензоил)-аминометил]-2'-дезоксиуридин-5'-

трифосфат NAB-4-dUTP —5-[Лг-(2-нитро-5-азидобензоил)-т/»анс-3-аминопропенил-1]-2'-

дезоксиуридин-5 '-трифосфат N АВ -7-dUTP —5 -{N-[N '-(2-нитро-5 -азидобензоил)-2-аминоэтионил] -транс-Ъ -аминопропенил-1} -2'-дезоксиуридин-5 '-трифосфат

NAB-8-dUTP—5-{Лг-[Л^'-(2-нитро-5-азидобензоил)-3-аминопропионил]-т/7днс-3-аминопропенил-1}-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат

NAB-9-dUTP—5-{Л^-[//'-(2-нитро-5-азидобензоил)-4-аминобутирил]-/иранс-3-

аминопропенил-1}-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат

NABdCTP -экзо-Л^-[3-(2-нитро-5-азидобензамидо)-этиламино]-дезоксицитидин-5'-

трифосфат

NS - неструктурные белки

NTP -нуклеозид-5'-трифосфат

PARP-1 - поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

Pfp - перфторфенильная группа

РЬзР - трифенилфосфин

PTHBEDS -8-(2-пиридил)-8'-{Л7-[3-(3-трифторметилдиазирин-3-ил)бензоил]-

аминоэтил}дисульфид
(РЬО)гРОСІ - хлорангидрид дифенилфосфорной кислоты
(PyS)2 - 2,2'-дипиридилдисульфид

Pyr-6-dUTP -5-{тУ-[4-(1-пиренил)-этилкарбонил]-3-амино-транс-пропенил-1}-2'-

дезоксиуридин-5'-трифосфат
RFC - репликативный белок С человека

RPA - репликативный белок А человека

s4dUTP - 4-тиодезоксиуридин-5'-трифосфат

SRP - сигнальная последовательность секреторных белков

ТВР - ТАТА-связывающий белок

TES - А^-трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновая кислота

TFII - транскрипционные факторы группы II

TFIII - транскрипционные факторы группы III

Tricine - Лг-трис(гидроксиметил)метилглицин

Tris - трис(гидроксиметил)аминометан

Tte ДНК-полимераза - ДНК-полимераза из экстремально термофильной бактерии Thermus

thermophilus В-35
АТФМД-тРНК- арил(трифторметил)диазирин-меченая тРНК
БХ - бумажная хроматография

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИОХ - ионообменная хроматография

MKA - моноклональные антитела

н.о. - нуклеотидное основание

ОТ ВИЧ - обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека

ОФХ - обращеннофазовая хроматография

САР - транскрипционный фактор активации транскрипции на /ас-промоторе

СМЕС - Л^-циклогексил-ТУ'-Р-(4-метилморфолиний)-этилкарбодиимид

СПЭВ - культивируемые клетки фибробластов почки эмбриона свиньи

СТМА - М-цетил-ТУ, ./ЧЛ'-триметиламмоний

СТС - JV-(3 -диметиламинопропил)-іУ '-циклогексилкарбодиимид

ТФУ - трифторуксусная кислота

ФИТЦ - флуоресциин

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Светлой памяти моего отца и Учителя

Сергея Ивановича Черникова

посвящается

Введение к работе

Настоящая работа выполнена в рамках научного направления - «Исследование биологических структур, обеспечивающих хранение генетической информации и экспрессию генов, и разработка методов направленного химического воздействия на эти структуры». Она является оригинальным исследованием (с 1986 г. по 2006 г.), направленным на развитие одного из информативных методов физико-химической биологии - метода фотоаффинной модификации белков, нуклеиновых кислот и их комплексов. Особое внимание в работе уделено изучению химических аспектов фотоаффинной модификации белков в связи с тем, что этот вариант биоспецифической модификации имеет очевидное преимущество, так как его использование открывает перспективу для изучения динамики функционирования надмолекулярных структур.

Репликация, транскрипция, биосинтез белка протекают с участием сложных надмолекулярных структур, состоящих из белков и нуклеиновых кислот (НК). Структуру белково-нуклеиновых комплексов изучают с помощью инструментальных методов, в первую очередь таких как рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Однако привлечение ЯМР-спектроскопии для изучения надмолекулярных структур ограничено чувствительностью метода и недостаточной разрешающей способностью, в силу чего этим методом практически невозможно выявить роль отдельных нуклеотидных и аминокислотных остатков при взаимодействии таких больших молекул как компоненты белково-нуклеинового комплекса.

Самым информативным методом исследования пространственного строения природных соединений является метод рентгеноструктурного анализа, который позволяет получать исчерпывающие данные о координатах атомов в молекуле и тем самым обеспечивает определение конфигурации каждого фрагмента молекулы и анализ ее конформации. Однако чаще всего данный метод невозможно применить для исследования нуклеопротеидных комплексов из-за того, что далеко не всегда можно получить кристаллы белок-нуклеиновых или белок-белковых комплексов, пригодные для кристаллографических исследований с высоким разрешением. В первую очередь это касается надмолекулярных комплексов эукариот. К тому же, методом РСА можно изучать пространственную организацию молекулярных структур лишь в кристаллическом

состоянии, хотя для понимания процессов, протекающих in vivo, гораздо более интересным является установление конформации молекул в растворе.

Достигнутые в последнее десятилетие значительные успехи в структурном анализе РНК- и ДНК-полимераз [1-6], рибосом и их функциональных комплексов с мРНК и тРНК [7-15] уже более прицельно ставят задачи, связанные с детальным изучением динамических процессов, в которых участвует ферменты и белки матричного биосинтеза. Ясно, что с использованием только метода рентгеноструктурного анализа достичь этих целей не удастся в силу сложности и динамичности названных систем. На сегодняшний день подходом, с помощью которого может быть получена детальная информация о структурно-функциональной топографии надмолекулярных комплексов, является метод химического аффинного сшивания. Именно ковалентное связывание белков с НК-лигандами открывает уникальную возможность фиксации белково-нуклеиновых комплексов, в том числе малостабильных, в определенном структурном состоянии. Многими исследователями предлагается использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА. Таким образом, значимость таких подходов и, в первую очередь, аффинного химического сшивания для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов не осталась в «дорентгеновской» эре. Эти методы востребованы и в настоящее время [16-24].

Для аффинной модификации белков чаще всего используют аналоги НК, содержащие различные реакционноспособные группировки в гетероциклических основаниях или углеводном остатке, на концевой или межнуклеотидной фосфатных группах. Особое место в арсенале химических реагентов занимают фотоактивируемые аффинные реагенты на основе ароматических азидов. Под действием облучения арилазидная группа превращается в высокореационноспособную частицу (нитрен), которая может атаковать соседние группы атомов с образованием ковалентной связи между контактирующими партнерами. Идентификация образованного продукта "фотосшивки" позволяет судить о структурной организации белково-нуклеинового комплекса, а также о динамике функционирования системы. В связи с этим, конструирование и синтез фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов является одной из приоритетных задач биоорганической химии.

Несмотря на широкое использование арилазидных реагентов в молекулярно-биологических исследованиях, эксперименты по фотоаффинной модификации белков обычно заканчиваются получением данных одно- или двумерного гель-электрофореза с определением белков, по которым прошла модификация. Отсутствие информации о природе образующейся химической связи не всегда позволяет экспериментатору выбрать

оптимальный путь и условия для выделения и анализа модифицированных белков. Это приводит к тому, что в случае лабильных связей утрачивается ценная информация об окружении реагентов в области связывания. Кроме того, из-за малой изученности природы продуктов модификации определенных аминокислотных остатков и механизмов их образования, подбор специфического реагента для каждого конкретного случая часто является недостаточно обоснованным. Фотохимические превращения арилазидных реагентов исследованы, как правило, для модельных соединений в неводных средах, т. е. в условиях, далеких от условий проведения фотоаффинной модификации белков и их комплексов. В связи с этим, полученные данные не могут объяснить ряд фактов, свидетельствующих о протекании в водных растворах реакций после прекращения облучения системы [25-28]. На момент начала выполнения настоящей работы единственной группой фотоаффинных реагентов, для которых была выявлена природа долгоживущпх интермедиатов, были производные и-азидоанилина. Ранее, авторами работ [29, 30] было показано, что при облучении в водных растворах и-азидоанилина и его нуклеотидных производных накапливаются соединения с хиноидной структурой, которые, являясь электрофилами, могут взаимодействовать с нуклеофильными группами белков. Отсутствие информации по механизмам фотолиза в водных растворах для других арилазидных реагентов не только затрудняет интерпретацию результатов фотоаффинной модификации биополимеров, но и в значительной степени сдерживает поиск «универсальных» арилазидных групп, т. е. таких, которые бы при возбуждении светом в ближнем ультрафиолетовом диапазоне могли бы с высокой эффективностью модифицировать разнообразные функциональные группы биомолекул.

Таким образом, изучение механизмов фотовзаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков представляет собой актуальную задачу, поскольку ее решение обеспечит развитие метода фотоаффинной модификации нуклеопротеидных комплексов - перспективного подхода не только для установления структуры и функции биополимеров и их комплексов, но и для направленного воздействия на них.

Цель настоящей работы - установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и разработка новых подходов к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

Задачи, на решение которых было направлено настоящее исследование:

изучение фотохимических превращений разного типа ароматических азидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров для выявления возможных вторичных, т. е. «темновых», процессов с их участием;

установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков;

дизайн и синтез новых фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для решения конкретных молекулярно-биологических задач.

Результаты проведенных исследований изложены в двух разделах диссертационной работы. Порядок появления разделов не связан ни с хронологией, ни с относительной важностью раздела. В разделе 2 представлены результаты исследований по установлению механизмов фотоиндуцированного взаимодействия ряда арилазидных реагентов, в основном, из числа широко используемых для фотоаффинной модификации белков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами, с боковыми радикалами аминокислот. Особое внимание уделено проблеме «темновых» процессов при фотоаффинной модификации белков.

Результаты, полученные при детальном исследовании процессов фотолиза ароматических азидов в водных растворах, и установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков не только проливают свет на механизмы фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами, но и представляют несомненную практическую ценность. Они позволяют сформулировать на качественном уровне некоторые зависимости направления фотоиндуцированных реакций арилазидных реагентов от строения субстрата (аминокислотного остатка) и типа заместителей в арильном кольце азида. Это способствует осознанному выбору фотоактивируемой группы при конструировании фотоактивируемого реагента.

В разделе 3 описаны подходы к созданию высокоэффективных фотоаффинных реагентов - арилазидных производных нуклеиновых кислот, способных реагировать с определенными типами функциональных групп белков в составе надмолекулярных комплексов. Разработанные подходы пост-синтетической селективной дериватизации монозамещенных концевых фосфатных групп олигонуклеотидов, в настоящее время нашли широкое применение в работах других научных коллективов, в том числе и зарубежных (например, [31]). Результаты работы, приведенные в разделе 3, демонстрируют то, как потенциал, заложенный при конструировании реагентов,

реализуется при изучении некоторых белково-нуклеиновых комплексов матричного биосинтеза.

В рамках данной работы впервые осуществлен ферментативный синтез
ДНК-дуплексов, содержащих арилазидные группы в С-5 положении дезоксиуридинов
обеих цепей ДНК, благодаря использованию 5-[3-()-(4-азидо-2,3,5,6-
тетрафторбензамидо)-пропенил-1 ] -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфата в качестве

фотоактивируемого аналога элонгирующего субстрата в полимеразной цепной реакции с 7а#-полимеразой. Это представляет практический интерес, например, для ферментативного синтеза фотоактивируемых ДНК-аптамеров, так как использование такого типа дезоксинуклеозид-5'-трифосфата позволяет исключить стадию пост-селекционной модификации . аптамера. Предложено новое направление использования арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

По материалам диссертации опубликовано 23 статьи, 2 обзора, 20 тезисов докладов.

Похожие диссертации на Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов