Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола Белоглазова Наталья Геннадьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Вирус гриппа, как мишень для действия антисмысловых олигонуклеотидов (обзор литературы) 9

1.1. Разнообразие ортомиксовирусов 10

1.2. Биологические свойства вируса гриппа 11

1.2.1. Структура вириона вируса гриппа 11

1.3. Структура генома, кодируемые белки и их функции 12

1.3.1. Организация генома вируса гриппа 12

1.3.2. Белки полимеразного комплекса и их гены 14

1.3.3. Белок нуклеокапсида и кодирующий его ген 16

1.3.4. Геммаглютинин и его ген 17

1.3.5. Гидролитическая активация НА и ее связь с патогенностью вирусов гриппа 19

1.3.6. Нейраминидаза и кодирующий ген 20

1.3.7. 7-ой сегмент геномной РНК вируса гриппа: структура и кодируемые белки 22

1.3.7.1. М1-белок матрикса 23

1.3.7.2. Строение и функция белка М2 28

1.3.8. 8-ой сегмент геномной РНК вируса гриппа: структура и кодируемые белки 28

1.3.8.1. Белок NS1 28

1.3.8.2. Белок NS2 29

1.4. Жизненный цикл вируса гриппа 29

1.4.1. Адсорбция вируса, проникновение в клетку и распаковка вирусной частицы 29

1.4.2. Особенности репродукции вируса гриппа 31

1.4.2.1. Синтез вирусных мРНК 33

1.4.2.2. Репликация вирионной РНК 35

1.4.3. Регуляция экспрессии вирусных белков в инфицированных клетках 36

1.4.4. Внутриклеточный транспорт вирусных белков, сборка вириона и почкование 37

1.4.4.1. Ядерно-цитоплазматический транспорт вирусных белков 37

1.4.4.2. Внутриклеточный транспорт интегральных белков вириона 37

1.4.4.3. Функциональная роль белка NS1 в регуляции экспрессии вирусных и клеточных генов 38

1.4.4.4. Регуляция уровня сплайсинга мРНК NS1 и М2 40

1.4.4.5. Влияние вируса гриппа на экспрессию клеточных белков 40

1.4.4.6. Сборка геномных сегментов и формирование вирионов 41

1.5. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для подавления репродукции вируса гриппа 45

1.5.1. Антисмысловые олигонуклеотиды в качестве антивирусных препаратов 45

1.5.2. Использование рибозимов для подавления развития вируса гриппа 54

Глава 2. Экспериментальная часть 58

2.1. Материалы 58

2.1.1. Реактивы и препараты 58

2.1.2. Плазмиды 59

2.1.3. Олигонуклеотиды 59

2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе 59

2.2. Методы 61

2.2.1. Рестрикционный анализ плазмидных ДНК 61

2.2.2. Клонирование М2 РНК вируса гриппа 61

2.2.3. Получение РНК с помощью транскрипции in vitro 62

2.2.4. Получение радиоактивномеченых препаратов РНК и олигонуклеотидов 63

2.2.5. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа методом пробинга 64

2.2.6. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами 65

2.2.7. Синтез коньюгатов олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций 67

2.2.8. Сайт-направленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов 67

2.2.9. Ингибирование сайт-направленного расщепления TPHKPhe конъюгатом 2В- R 67

2.2.10. Молекулярное моделирование 68

2.2.11. Гель-злектрофорез 68

Глава 3. Химические рибонуклеазы - коньюгаты 1.4 - диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола, как зонды для исследования структуры РНК в растворе (Результаты и обсуждение) 69

3.1. Дизайн химических рибонуклеаз 69

3.2. РНК модели 70

3.3. Схема эксперимента 71

3.4. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз 71

3.4.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm ...71

3.4.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и эффективность расщепления 77

3.4.3. Влияние концентрации соединений ABL3Cm на скорость расщепления РНК 79

3.4.4. Кинетика расщепления РНК соединениями ABL3Cm ^..83

3.4.5. Эффективность расщепления РНК искусственными рибонуклеазами 91

3.4.6. Доказательство каталитического характера расщепления фосфодиэфирных связей в РНК под действием ABL3Cm 92

3.4.7. Доказательство того, что расщепление РНК происходит под действием искусственных рибонуклеаз 93

3.5. Влияние условий проведения реакции на процесс расщепления РНК искусственными РНКазами 94

3.5.1. Влияние природы буфера на расщепление РНК соединениями ABL3Cm 94

3.5.2. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединениями ABL3Cm „..98

3.5.3. Влияние температуры на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей

в РНК соединениями ABL3Cm 98

3.6. Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз 100

3.7. Применение искусственных рибонуклеаз для исследования пространственной

структуры РНК в растворе 103

3.7.1. Пробинг вторичной структуры in vitro транскриптов митохондриальных TPHKLys, дикого типа (Kwt) и содержащего замену (А9->С) (Krw) 103

3.7.2. Пробинг вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа 108

Глава 4. Направленное расщепление РНК коньюгатами антисмысловых олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями 116

4.1. Синтез коньюгатов олигонуклеотидов путем пост-синтетической модификации и выбор РНК мишени 117

4.2. Направленное расщепление дрожжевой TPHKPhe коньюгатами с моно- и бисимидазолсодержащими конструкциями 118

4.2.1. Специфичность и эффективность расщепления тРНКРЫг коньюгами олигонуклеотидов, несущих моно- и бисимидазолсодержащие конструкции 118

4.2.2. Кинетические и концентрационные закономерности расщепления РНК коньюгатом

2B-R2 124

4.2.3. Влияние природы буфера на скорость направленного расщепления РНК 125

4.2.4. Доказательство протекания расщепления РНК в составе комплементарного комплекса 125

4.2.5. Расщепление высокомолекулярных РНК коньюгатами олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций 126

4.3. Сайт-направленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов, несущих имидазолсодержащие дендримерные конструкции 128

4.3.1. Дизайн коньюгатов олигонуклеотидов, содержащих от 2-х до 32-х остатков имидазола 128

4.3.2. Постановка эксперимента 129

4.3.3. Исследование сайт-направленного расщепления TPHKPhe коньюгатами олигонуклеотидов с дендримерными имидазолсодержащими химическими конструкциями 130

4.3.4 Ингибирование сайт-направленного расщепления тРНКРЬе коньюгатами 137

4.3.5. Расщепление TPHKPhe коньюгатами, несущими бисимидазолсодердащие конструкции 2B-dl2(m) 136

4.3.6. Направленное расщепление тРНКРЬе коньюгатами, несущими тетраимидазолсодердащие конструкции 2B-dl4(m) 139

4.3.7. Направленное расщепление TPHKPhe коньюгатами, несущими от 8-й до 32-х остатков имидазола в составе гидролизующей конструкции 142

4.3.8. Влияющие условий проведения реакции и структуры коньюгатов 2B-dlk(m) на эффективность направленного расщепления TPHKPhe 143

4.3.9. Молекулярное моделирование искусственных РНКаз 147

Выводы 158

Список литературы 159

• Применение антисмысловых олигонуклеотидов для подавления репродукции вируса гриппа
• Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm
• Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз
• Сайт-направленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов, несущих имидазолсодержащие дендримерные конструкции

Введение к работе

Создание соединений, способных с высокой эффективностью расщеплять РНК в физиологических условиях, представляет интерес для решения ряда фундаментальных задач молекулярной биологии. Изучение свойств таких соединений, получивших название искусственных или химических рибонуклеаз, может помочь выявлению роли структурных и динамических факторов, обеспечивающих высокую эффективность катализа, осуществляемого природными ферментами. Молекулы небольшого размера, способные расщеплять РНК, представляют интерес, как в качестве реагентов для исследования структуры РНК, так и для целей биотехнологии. РНК-гидролизующие ферменты, используемые для исследования пространственной структуры РНК, изменяют конформацию РНК при взаимодействии с ними, что вносит искажения в структуру изучаемого объекта и отражается на достоверности полученных структурных данных [1]. Малые органические соединения расщепляют РНК, не изменяя их конформацию, и позволяют получить информацию о состоянии невозмущенной природной структуры РНК.

Присоединение РНК-гидролизующих конструкций к антисмысловым олигонуклеотидам открывает путь к созданию сверхспецифичных рибонуклеаз, обладающих способностью направленно расщеплять только определенные молекулы РНК, что дает возможность селективного воздействия на экспрессию определенных генов с целью коррекции биохимических процессов. Химические соединения, катализирующие направленное расщепление РНК и способные проникать в клетки, могут оказаться активными противовирусными препаратами, инактивирующими геномы РНК-содержащих вирусов (вирус HIV 1, вирус клещевого энцефалита, вирус гриппа и т. д.).

На момент начала данной работы в 1997 г. в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот НИБХ СО РАН было исследовано расщепление РНК феназин-имидазольными конъюгатами и спермин-имидазольными конъюгатами [2,3]. В настоящей работе впервые изучены химические рибонуклеазы на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана. В работе-' впервые исследованы в реакции сайт-направленного расщепления РНК новые виды конъюгатов олигонуклеотидов с моно- и бисимидазолсодержащими конструкциями, присоединенными через антраценовый линкер, и конъюгаты олигонуклеотидов с дендримерными имидазолсодержащими конструкциями.

Целью настоящей работы являлось изучение расщепления РНК под действием низкомолекулярных катализаторов - конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, а также направленное расщепление РНК с помощью конъюгатов антисмысловых

олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций. В ходе исследования решались следующие задачи:

определение позиционной направленности расщепления РНК различными конъюгатами и изучение влияния последовательности и пространственной структуры РНК на эффективность реакции;

изучение закономерностей протекания реакции;

оценка возможности применения искусственных рибонуклеаз в качестве зондов для исследования пространственной структуры РНК в растворе;

изучение направленного расщепления РНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидами, несущими имидазолсодержащие конструкции разных типов.

Применение антисмысловых олигонуклеотидов для подавления репродукции вируса гриппа

Принципиальная возможность применения антисмысловых олигонуклеотидов в качестве антивирусных агентов была впервые продемонстрирована в работах [294, 295]. Было показано, что 13-звенный олигодезоксинуклеотид вызывает специфическое ингибирование роста и репликации вируса саркомы Рауса в культуре клеток. Результаты этого исследования не были научно убедительны, но позволили предположить широкие возможности применения антисмысловых олигонуклеотидов в противовирусной терапии, в том числе и против вируса гриппа. Для преодоления цитопатологического эффекта, оказываемого вирусом гриппа в отношении инфицированных клеток, были использованы коньюгаты олигонуклеотидов с акридином [296]. Адресующие 6-ти и 9-звенные олигонуклеотиды этих коньюгатов были комплементарны консервативной последовательности, расположенной в З -концевой области всех восьми сегментов геномной РНК вируса гриппа А. Ундекануклеотид-акридиновые коньюгаты не проявили активности против штамма A/Victiria/3/75 в клетках MDCK, тогда как гептануклеотидные коньюгаты ингибировали цитопатическое действие вирусов гриппа A/Victiria/3/75, A/Philippines/2/82 и A/PR/8/34 на 50-88%. Аналогично, эти производные вызывали существенное снижение эффективности транскрипции вирионных РНК, катализируемой РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса гриппа in vitro.

С целью поиска производных олигонуклеотидов, способных ингибировать функции белков транскрибирующего комплекса вируса гриппа в работе Ледовских с соавт. было исследовано действие производных олигонуклеотидов сІ(Т)з, d(T)4, d(T)3, d(T)8, d(T)10, d(CCAAACA), d(TCACCCTC), d(TTCCCATT), d(AATACTCT) и d(TCACCCTTCCCATT), несущих на б -концевом фосфате и (или) на З -концевом фосфате остатки этидия, дейтеропорфирина и его комплекса с Fe3+, гемина, холестерина, дейтеротестостерона, эстрона и нафтохинона, на транскрипцию РНК вируса гриппа в бесклеточной системе икультивируемой линии фибробластов мыши [297]. Выбор мишени авторы объясняли тем, что, во-первых, мутации в активных центрах ферментов обычно летальны для них, и, во-вторых, эти участки ферментов традиционно более консервативны, и поэтому лиганды, обладающие повышенным сродством к активным центрам белков транскрипционного комплекса, представлялись наиболее перспективными ингибиторами. Для увеличения эффективности взаимодействия в олигонуклеотиды вводились группы, обладающие высокой гидрофобностью, заряженные группы, ионы металлов, которые потенциально способны образовывать дополнительные контакты с полинуклеотид-зависимыми белками. Было показано, что наибольшей эффективностью и селективностью обладали производные олигонуклеотидов, имеющие длину 7-10 звеньев. Производные порфиринов в концентрации 10 мкМ ингибировали развитие вируса в клетках на 40-63%. Близкое ингибирующее действие (58-73%) для этих соединений было обнаружено при исследовании их влияния на синтез РНК в бесклеточной системе, где функционирование РНК-зависимой РНК полимеразы вируса не зависит от эндонуклеазы и кэп-связывающего белка. Производные холестерина, исследованные в этой работе, были эффективны только в клеточной системе (80-85%), а их действие на реакцию полимеризации in vitro было заметно ниже - 19-40%. По мнению авторов, это объясняется тем, что такие аналоги олигонуклеотидов взаимодействуют не только с РНК-полимеразой, но имеют сродство к специфической нуклеазе или кэп-связывающему участку белка РВ2.

Эффективность подавления трансляции белков вируса гриппа под действием антисмысловых олигонуклеотидов во многом определяется эффективностью их взаимодействия с высокомолекулярными вирусными РНК, которая может быть увеличена путем введения в структуру олигонуклеотидов различных группировок. С этой целью в работе Абрамовой и соавт. был проведен сравнительный анализ действия олигонуклеотида, комплементарного б -концу мРНК (положения 1-16) структурного белка вириона NP, и его производных, несущих на б -концевом фосфате остатки ароматического 2-хлорэтиламина, холестерина, порфирина и феназина, на синтез этого белка в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика [298]. Среди исследованных производных наиболее сильным ингибирующим эффектом на синтез вирусного белка обладали алкилирующие и холестериновые производные. В их присутствии в концентрации 10 мкМ синтез NP белка блокировался на 66% и 38%, соответственно. Порфириновые и феназиниевые производные олигонуклеотидов оказались слабыми ингибиторами и практически не подавляли синтез белка NP in vitro. Скрининг ингибирующей способности различных производных олигонуклеотидов в культуре клеток, инфицированных вирусом гриппа, проведенный в работах [297, 298], показал, что перспективно использовать модифицированные аналоги антисмысловыхолигонуклеотидов, поскольку такие производные проявляют более выраженный ингибирующий эффект, вероятно, за счет образования более прочных комплексов с мРНК.

Подавление развития вируса гриппа в принципе может быть достигнуто путем блокирования процессов транскрипции, трансляции или репликации вирусных РНК, осуществляемых как вирусспецифическими ферментами, так и белками клетки-хозяина. Поэтому в качестве мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов использовались и вРНК, представляющие собой сегменты вирусного генома, и мРНК, кодирующие вирусные белки. Традиционно считается, что наиболее эффективно подавление развитие вируса может быть достигнуто за счет действия производных олигонуклеотидов на мРНК и сегменты генома, кодирующие белки-компоненты полимеразного комплекса вируса. Поэтому, в большинстве работ, посвященных созданию и изучению антивирусных соединений на основе коньюгатов или аналогов олигонуклеотидов олигонуклеотиды адресовали либо к мРНК, либо к геномным сегментам, кодирующим белки РВ1, РВ2 и РА-субъединицы полимеразного комплекса. Выбор последовательности антисмысловых олигонуклеотидов авторы большинства работ проводили исходя из соображений функциональной значимости участка РНК, и степени его консервативности, что при работе с вирусом гриппа является чрезвычайно важным.

Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm

На рис. 15 представлен радиоавтограф геля после разделения продуктов расщепления олигорибонуклеотида [5 -32P]UUCAUGUAAA соединением ABL3C1 в стандартных условиях. Видно, что ABL3C1 обладает выраженной рибонуклеазной активностью: после 7 ч инкубации олигорибонуклеотид расщепляется практически количественно (92%). Эксперименты, проведенные с использованием [5 -32Р] и [3 -32Р] меченого олигорибонуклеотида UUCAUGUAAA, показали, что расщеплению подвергаются только фосфодиэфирные связи С3-А4 и U7-A8, причем расщепление связи С3-А4 протекает в 2.6-3.4 раза быстрее, чем связи U7-A8. При этом расщепление по обеим связям протекает параллельно, что подтверждается постоянным соотношением продуктов расщепления, составляющим 3.4±0.2, независимо от того, 5 - или 3 - меченый олигонуклеотид использован в эксперименте. Рис. 15. Расщепление синтетического декарибонуклеотида UUCAUGUAAA соединением ABL3C1. А. Последовательность олигорибонуклеотида с указанием фосфодиэфирных связей расщепляемых под действием соединения ABL3C1. Б. Анализ продуктов расщепления 5-Ю"6 М [5;-32Р]UUCAUGUAAA с помощью 5-Ю"5 М соединения ABL3C1 в 15%-ном денатурирующем ПААГ. Реакцию проводили при 37С в буфере Im-. С - контроль, инкубация олигонуклеотида без добавления расщепляющего реагента; 1 - 7 - инкубация [5 -32P]UUCAUGUAAA с ABL3C1 в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 ч, соответственно. Данные для [3 -32Р]-меченого олигорибонуклеотида не приводятся, так как расположение на радиоавтограмме полос, соответствующих продуктам расщепления, специфичность и степень расщепления не изменяются при изменении места положения радиоактивной метки. Расщепление фосфодиэфирных связей в [З - РІтРНК1 8 химическими рибонуклеазами ABL3C1, ABL3C2 и ABL3C3 носит неслучайный характер. Каждое из соединений расщепляет с максимальной эффективностью 3-4 фосфодиэфирных связи и ещё несколько связей подвергается гидролизу в меньшей степени. Результаты экспериментов показали, что расщепление тРНК происходит в основном после остатка пиримидина перед пуриновым основанием в мотивах СрА, UpA и CpG, которые располагаются преимущественно в одноцепочечных районах молекулы (рис. 16, А). Основными сайтами расщепления тРНКРНе под действием соединений ABL3C1, ABL3C2 и ABL3C3 являются последовательности СрА (С75, С72, С63, С61 и С13). Менее интенсивно гидролиз происходил в последовательностях CpG (С25), UpA (U8), СрА (С28) и последовательности GpA (G65).

Кроме того, несущественному расщеплению подвергаются связи, расположенные в Тц/С петле, после оснований С56 и Рис. 16. Расщепление дрожжевой TPHKPhe искусственными РНКазами ABL3Cm. А. Сайты расщепления дрожжевой тРНКРИе соединениями ABL3Cm. Вторичная структура тРНКРНе приведена в соответствии с работой [335]. Размер стрелки соответствует чувствительности данной связи к расщеплению. Б. Радиоавтограф 12%-ного денатурирующего ПААГ после разделения продуктов расщепления [З - Р РНК 6 соединениями ABL3C1, ABL3C2 и ABL3C3 при 37 в течение 18 ч в буфере lm- (дорожки 1, 3, 5, соответственно) и в буфере lm+ (дорожки 2, 4, 6, соответственно). L и Т - частичное расщепление тРНК в 2 М имидазольном буфере и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно; С1 и С2 - контроли, инкубация тРНК без расщепляющих реагентов в течение 0 и 18 ч, соответственно. Положения расщепления РНК соединениями ABL3Cm указаны на радиоавтографе справа, РНКазой Т1 - слева. Позиционная специфичность расщепления тРНК соединениями ABL3Cm практически не различается (рис. 16, Б), наблюдается лишь изменение интенсивности расщепления отдельных связей в присутствии ABL3C3 по сравнению с ABL3C1 и ABL3C2. В присутствии соединений ABL3C1 и ABL3C2 расщепление протекает преимущественно по связям после оснований С61, С6з, G65, U8, С13, С28, С56. Интенсивность расщепления тРНК по связям после C6i, С63, G65, U8 и С13 под действием соединения ABL3C3 сравнима с интенсивностью, наблюдаемой для ABL3C1 и ABL3C2, а расщепление фосфодиэфирных связей С28-А и C56-G протекает со значительно большей скоростью. Кроме того, в присутствии соединения ABL3C3 наблюдается появление продуктов, соответствующих слабому расщеплению связей в районе модифицированных оснований T\\JC петли, G53, Т54-іЛ а также в мотиве C4 rU. Таким образом, в тРНКРИе основными фосфодиэфирными связями, чувствительными к действию соединений ABL3Cm являются связи, расположенные в СрА последовательностях. TPHKPhe содержит 6 мотивов СрА, и все они расщепляются в присутствии реагентов (рис. 17). Аналогичным образом происходило расщепление мотивов UpA. Степень расщепления других последовательностей была существенно ниже. Только две из 6 последовательностей CpG, присутствующих в структуре тРНК, расщепляются под действием ABL3Cm, причем фосфодиэфирная связь C25-G26, расположена в участке перекрещивания стеблей (junction), а связь C56-G57, — в Т\ С петле. Единственная чувствительная к действию искусственных РНКаз фосфодиэфирная связь в мотиве GpA также расположена в области перекрестка (junction), то есть в участке с напряженной структурой (рис. 16). При одновременном учете наблюдаемой степени расщепления РНК и соотношения между количеством встречающихся и гидролизуемых последовательностей оказывается, что не менее 90% всех связей, подвергающихся расщеплению под действием ABL3Cm, находится в СрА и UpA мотивах.

Анализ структурной специфичности расщепления тРНК конъюгатами ABL3Cm показывает, что с наибольшей эффективностью расщепляются связи, расположенные в открытых участках структуры (С13-А14, C55-G56, U59-C6o, С72-А73, С75-А7б), в районах соединения стеблей (U8-A9, C25-G26, G65-A66) и областях перехода стебля в петлю, то есть в участках с напряженной структурой (С28-А29, С61-Аб2, Сбз-Аб4) (рис. 16). Расположение в тРНКРЬе фосфодиэфирных связей, расщепляемых соединениями ABL3Cm, свидетельствует о чувствительности синтезированных соединений к пространственной структуре РНК. Были проведены эксперименты, целью которых было оценить изменение позиционной специфичности расщепления при увеличении времени инкубации тРНК с реагентами. Оказалось, что специфичность расщепления РНК сохраняется даже при существенном увеличении времени проведения реакции. При инкубации тРНКРЫэ в присутствии соединений ABL3Cm в течение 48 ч и 96 ч не наблюдается появления дополнительных сайтов расщепления. Расщепление TPHKASP, полученной с помощью транскрипции in vitro (далее TPHKASP), под действием соединений ABL3Cm проходит по пяти фосфодиэфирным связям, расположенным исключительно в СрА и UpA последовательностях: U8-A9, U13-A14, Сго-Аг-ь С43-А44 и С56-А57 (рис. 18). По этим же положениям с наибольшей эффективностью проходит гидролиз TPHKASP И ПОД действием РНКазы А. В присутствии РНКазы А наблюдается также расщепление связей после С3, U5, U16, U25, U33, U35 и U65, хотя и в меньшей степени (рис. 18, А). Расположение участков расщепления TPHKASP соединениями ABL3Cm представлено на рис. 18, Б. Анализ позиционной специфичности расщепления различных РНК субстратов соединениями ABL3Cm показывает, что наиболее чувствительными к расщеплению являются фосфодиэфирные связи в СрА и UpA последовательностях. Повышенная чувствительность к гидролизу последовательности 5 -Ру-А-3 хорошо известна [349]. Эти же участки, как правило, являются точками спонтанного гидролиза РНК [350]. Несмотря на большой интерес, проявляемый к этому явлению, природа повышенной чувствительности фосфодиэфирной связи в последовательности Ру - А к гидролизу до сих пор не вполне понятна. Изучение спонтанного гидролиза динуклеозидмонофосфатов показало, что расщепляются в основном фосфодиэфирные связи в СрА и UpA последовательностях [351]. Исследование самопроизвольного гидролиза модельных соединений показало, что скорость расщепления связи в UpA мотиве в 1.5-2 раза выше, чем в СрА [352-354], и сильно зависит, как от основания, фланкирующего расщепляемую связь, так и от вторичной структуры РНК. Спонтанный гидролиз РНК происходит в основном в Ру-А-последовательностях, расположенных в одноцепочечных участках [350].

Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз

Изучение влияния температуры на расщепление РНК соединениями серии ABL3Cm проводили в интервале температур от 33 до 60С. Известно, что диазабицикло[2.2.2]октан обладает повышенным сродством к нуклеиновым кислотам [361]. Следовательно, если это взаимодействие играет ключевую роль в процессе расщепления фосфодиэфирных связей в РНК под действием ABL3Cm, то при повышении температуры должно происходить снижение скорости реакции. Из данных, представленных на рис. 30, видно, что скорость гидролиза [3 -32Р]тРНКРІ1е соединением ABL3C3 имеет характерную для простых химических реакций зависимость от температуры. В области температур от 33 до 50С происходит плавный рост степени расщепления РНК. При дальнейшем повышении температуры от 50 до 60 С наблюдается троекратное увеличение скорости реакции, что скорее всего связано с плавлением вторичной структуры тРНК, благодаря чему расщепляемые связи становятся более доступными для ABL3C3. Следует отметить, что при повышении температуры вплоть до 60С позиционная специфичность расщепления не изменяется, то есть новые сайты гидролиза не возникают. Анализ кривой, характеризующей зависимость скорости гидролиза РНК ABL3C3 от температуры, еще раз подтвердил вывод об отсутствии прочного связывания соединений ABL3Cm с РНК в процессе реакции расщепления. 3.6. Механизм расщепления РНК под действием соединений ABL3Cm

Результаты кинетических исследований (раздел 3.3.4) позволяют предположить, что расщепление РНК по всем чувствительным связям, катализируемое соединениями ABL3Cm, протекает, как ряд параллельных и независимых реакций, кооперативных эффектов при этом не наблюдается. Для подтверждения данного предположения расщеплению соединением ABL3C3 подвергали TPHKASP, меченную 32Р по 5 - или по 3 -концу. На рис. 31 приведены кинетические кривые накопления продуктов гидролиза [3 -32Р] и [5 -32P]TPHKASP по трем наиболее характерным участкам, U8-A9, C2o-A2i, С56-А57, расположенным симметрично относительно 3 - и 5 - концов молекулы. Накопление фрагментов средней длины характеризуется колоколообразной кривой (рис. 24, кривые 2 и 5). Видно, что кинетические кривые накопления фрагментов определенной длины совпадают, как для 3 - так и 5 - меченой РНК. Это свидетельствует в пользу независимого характера расщепления РНК по каждой чувствительной к действию ABL3C3 связи. Многие из описанных в литературе синтетических рибонуклеаз являются миметиками активных центров природных РНК-гидролизующих ферментов, поскольку механизм расщепления фосфодиэфирных связей в РНК этими соединениями сходен с механизмом гидролиза, протекающим под действием природных рибонуклеаз. Первой стадией расщепления РНК под действием РНКазы А является реакция переэтерификации. На этом этапе 2 -гидроксильная группа рибозы атакует межнуклеотидный фосфат с образованием циклического г .З -циклофосфата и 5 -гидроксильной группы. Вторая стадия включает гидролиз циклического 2 ,3 -циклофосфата, полученного на первой стадии. Гидролиз РНК, катализируемый РНКазой А, как и многими другими РНКазами, протекает всегда с образованием З -фосфата и 5 -ОН группы в сайте расщепления [366]. Была предпринята попытка сравнить механизм расщепления фосфодиэфирных связей в РНК под действием соединений ABL3Cm с механизмом гидролиза РНК, катализируемого РНКазой А. С этой целью немеченую тРНКРЬе подвергали расщеплению соединением ABL3C3 в оптимальных условиях (раздел 2.2.6.1).

По окончании реакции получившиеся фрагменты фосфорилировали [у-32Р]АТР с помощью полинуклеотидкиназы и анализировали их электрофоретическую подвижность. Результаты анализа показали, что подвижность фрагментов после фосфорилирования отличается от подвижности исходных фрагментов, различие в подвижностях продуктов соответствует разнице на одну фосфатную группу. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что продукты расщепления тРНК соединением ABL3C3 имеют свободную гидроксильную группу на 5 конце. В последующих экспериментах в качестве субстрата для соединения ABL3C3 использовали синтетический декарибонуклеотид UUCAUGUAAA. Данные представлены на рис. 32. Видно, что при обработке продуктов расщепления додекарибонуклеотида 0.1 М HCI происходит увеличение их электрофоретической подвижности (рис. 32, дорожки 3 -4). При этом подвижность продуктов расщепления декарибонуклеотида РНКазой А и ABL3C3 изменяется одинаково. Эти данные свидетельствуют в пользу того факта, что на начальных стадиях гидролиза РНК соединениями ABL3Cm образуются те же продукты, что и при гидролизе РНКазой А. . Позже результаты этих исследований были полностью подтверждены при изучении расщепления динуклеозидмонофосфата СрА соединением ABL3C3. В работе [343] в результате наблюдения за начальной стадией гидролиза СрА было показано образование аденозина и г .З -циклофосфата цитидина. При гидролизе СрА РНКазой А одновременно с образованием циклофосфата происходил его дальнейший гидролиз до Ср(З ), тогда как в случае ABL3C3 образования Ср(З ) практически не наблюдалось. Вероятно, в отличие от природного фермента, соединения ABL3Cm не могут с высокой эффективностью связывать г .З -циклофосфат цитидина, что и приводит к остановке гидролиза на стадии образования г .З -циклофосфата. Полученные нами данные по влиянию природы буфера (раздел 3.4.1) на эффективность расщепления РНК соединениями ABL3Cm позволили предположить, что в акте катализа участвует один остаток имидазола и, возможно, прилегающая к этому имидазолу пептидная связь. Однако эти результаты были получены в условиях избытка соединений ABL3Cm по отношению к суммарному количеству фосфатов в реакционной смеси. В этом случае сохраняется вероятность того, что в акте катализа фосфодиэфирной связи РНК участвуют два остатка имидазола двух разных молекул

Сайт-направленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов, несущих имидазолсодержащие дендримерные конструкции

Конъюгаты, несущие дендримерные конструкции, содержащие от 2-х до 32-х остатков имидазола синтезированы, выделены и охарактеризованы Н.Н. Полушиным (Fidelity System Inc., USA), конъюгаты, содержащие 2 и 4 остатка имидазола и различающиеся типом линкерной группы, синтезированы В.Н. Сильниковым (НИБХ СО РАН). В основу синтеза олигонуклеотидных конъюгатов с использованием групп-предшественников положен принцип блочного построения дендримерных конструкций, которые в виде фосфорамидитов вводили на б -конец олигонуклеотида в процессе олигонуклеотидного синтеза. Полученный олигонуклеотид-предшественник, содержащий метоксиоксалатные группы, функционализировали остатками гистамина одновременно с деблокированием. Дендримерные конструкций содержали гибкие линкеры различной длины и сложности. Предполагалось, что при достаточной длине и подвижности конструкций и при большом числе потенциальных каталитических центров, часть из них окажется ориентированными оптимальным образом относительно гидролизуемой фосфодиэфирной связи.

Все конъюгаты по типу якорной группы можно разбить на следующие группы: тип 1 - в качестве якорной группы использовали циклогексильный остаток; тип 2 и 3 - дендримерные конструкции присоединяли к остатку дезокситимидина или уридина по С17 положению, которые и служили якорными группами. Тип 4 -включение дендримерной конструкции проводили, используя ненуклеотидную вставку. Кроме того, для каждого типа якорной группы дендримерные конструкции различались длиной и строением. В некоторые конструкции для увеличения их подвижности дополнительно были включены циклогексильные радикалы и/или остатки фосфорной кислоты. Структуры якорных групп и реакционной части конъюгатов приведены на рис. 44 и 45. Для обозначения конъюгатов использовали общую формула 2B-dlk(m), в которой 2В обозначает исходный олигонуклеотид длиной 16 оснований, комплементарный последовательности 44-60 TPHKPhe, расположенной в З -части молекулы; dl -дендримерную имидазолсодержащую конструкцию, к - число имидазольных групп в гидролизующей конструкции, m -тип якорной группы. Гибридизация олигонуклеотида 2В с тРНК способствует локализации имидазольных групп каталитического центра вблизи последовательности CCACAG ТТС стебля, известной своей повышенной чувствительностью к гидролизу соединениями, содержащими остатки имидазола (глава 3), и РНКазой А (рис. 39). После синтеза и выделения с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ конъюгаты дополнительно очищали с помощью электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Конъюгаты, содержащие разное число имидазольных остатков, обладают различной электрофоретической подвижностью (рис. 46). Структура конъюгатов и число имидазольных остатков подтверждены Н.Н. Полушиным с помощью данных масс-спектроскопии. Эксперименты по изучению рибонуклеазной активности конъюгатов 2B-dlk(m) проводили по следующей схеме. Меченную [32Р] по З -концу TPHKPhe инкубировали в течение заданного времени в присутствии одного из соединений 2B-dlk(m), взятого в концентрации от 50 нМ до 50 мкМ в разных буферах и при различных температурах.

Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Для идентификации связей, расщепляемых в TPHKPhe конъюгатами 2B-dlk(m), параллельно проводили обработку этой же РНК 2 М имидазольным буфером, рН 7.0, или рибонуклеазой Т1 в денатурирующих условиях, что 9 10 11 12 13 14 15 16 17 позволяло получить частичное расщепление РНК либо по всем фосфодиэфирным связям [348], либо после остатков гуанина, соответственно [345]. Определение сайтов расщепления проводили путем сравнения электрофоретическои подвижности продуктов гидролиза РНК конъюгатом, в 2 М имидазольном буфере и РНКазой Т1. Для корректного сравнения скорости и специфичности расщепления РНК, данные, полученные в любых использованных условиях, сопоставляли с аналогичными данными для стандартных условий (раздел 2.2.8). Относительная ошибка не превышала 10%. Рибонуклеазную активность коньюгатов олигонуклеотидов с дендримерными конструкциями тестировали в условиях избытка конъюгата по отношению к РНК. Концентрацию реагентов варьировали в широком диапазоне от 0.5 мкМ до 500 мкМ, время реакции -до 18 часов. Проведенные исследования показали, что все исследуемые конъюгаты, независимо от структуры линкернои группы и числа остатков имидазола в каталитической части, расщепляют тРНК с одинаковой специфичностью. Гидролизу в основном подвергается фосфодиэфирная связь С6з-А64, отстоящая на четыре основания от участка связывания олигонуклеотида, и в меньшей степени связь

Похожие диссертации на Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола

Конструирование и синтез искусственных рибонуклеаз на основе 1,4-диазабицикло(2.2.2) октана и имидазолаКоневец Дмитрий Александрович

Физико-химические свойства и механизм расщепления РНК соединениями, не содержащими функциональных групп, катализирующих реакцию трансэтерификацииКовалев Николай Алексеевич

Катализаторы расщепления РНК-пептидилолигонуклеотиды и органические соединения, включающие основные аминокислоты и катионные структурыМиронова Надежда Львовна

Неферментативная рекомбинация молекул РНК в реакциях расщепления/лигированияЛутай Алексей Валериевич

Регуляция плотности рецепторов производных 1,4-дигидропиридина в плазматической мембране фибробластов человекаЧернюк, Наталья Николаевна

Синтез и изучение производных 3-(индол-1-ил)малеинимидов и диазепинов[1,4], аннелированных с малеинимидным и индольными цикламиСимонов, Александр Юрьевич

Синтез 3,4,5-тризамещённых 1,2,4-триазолов из триазолилтиоловИванова Наталья Викторовна

Аналоги нуклеозидов, содержащие 1,2,4-триазольный фрагментМатвеев, Андрей Валерьевич

Конъюгаты на основе комплексов палладия(II) копропорфиринов с 1,2,4,8,9,11-гексаазациклотетрадека-7,14-диен-3,10-дионамиВолов, Александр Николаевич

Направленный синтез и исследование мезоморфных свойств 2,7-дизамещенных 2,3,4,9-тетрагидро-1H-флуоренов, 1,4-бицикло[2.2.2]октанов и 1,8-трицикло[4.4.0.03,8]деканов (твистанов)Межнев, Василий Викторович