Введение к работе
Актуальность проблемы. Формирование клеточных органелл -процесс чрезвычайно сложный, требующий участия всевозможных вспомогательных белков, функции которых в клетке зачастую только этим участием и ограничиваются. Сказанное можно проиллюстрировать на примере митохондрий, биогенез которых сравнительно хорошо изучен.
Известно, что подавляющее большинство митохондриальных белков (80-90%) синтезируется в цитоплазме в виде предшественников с N-конце-вой адресующей препоследовательностью, которые пост-трансляционно переносятся в органеллы. В целом, механизм белкового импорта предусматривает участие цитоплазматических факторов, поддерживающих белковые предшественники в транспортно-компетентной форме, транслоцирующих комплексов внешней и внутренней мембраны, а также системы шаперонов, локализованной в матриксе. Как правило, наличие у белка специфической адресующей последовательности, а также способности обратимо разворачиваться являются необходимыми и достаточными условиями для его импорта в митохондрии. Другими словами, согласно современным представлениям, механизм импорта универсален и вряд ли может быть органо- или видо-специфическим. Тем не менее, оказалось, что такого рода ограничения на импорт вполне могут иметь место. В частности, это касается предшественника цитохрома P450scc - резидентного белка митохондрий коры надпочечников, отвечающего за конверсию холестерина в прегненолон, продукта гена CYP1IA1.
Ранее была продемонстрирована неспособность этого белка импортироваться в сердечные митохондрии, что послужило основанием для предположения, согласно которому пре-цитохром P450scc импортируется только в митохондрии стероидогенных тканей. Однако, в последние годы было
показано, что он способен включаться в митохондрии COS-1 клеток in vivo, а также в изолированные растительные митохондрии. Хотя при синтезе в COS-1 клетках цитохром P450scc, в принципе, проявлял холестерингидрок-силазную активность, оставалось неясным насколько эффективен его импорт в гетерологические митохондрии, т.е. какая доля молекул принимает каталитически активную'форму, где они Локализованы внутри органелл и т. д. Иными словами, является ли именно импорт в митохондрии лимитирующей стадией в топогенезе этого белка или же какие-то затруднения возникают на стадиях его встраивания во внутреннююмитохондриальную мембрану (обычное место локализации этого белка), связывания гема или. формирования третичной структуры.
Кроме того, изучение импорта пре-цитохрома P450scc в гетерологические митохондрии представляет интерес для выяснения судьбы чужеродных белков, попадающих в эти органеллы в результате ошибочного адресования, что имеет место при некоторых патологических состояниях клетки. С другой стороны, решение ряда биотехнологических проблем связано именно с импортом чужеродных белков (в том числе цитохрома P450scc) в митохондрии.
Цель работы.' Целью настоящей работы явилось изучение особенностей биогенеза цитохрома P450scc быка в митохондриях дрожжевых клеток, а также выяснение роли митохондриальных протеиназ и шаперонов в этом процессе.
Научная новизна и практическая ценность. С помощью генно-инженерных подходов показана возможность управления топогенезом цитохрома P450scc путем модификации или замены его адресующей препоследовательности Изучен биогенез цитохрома P450scc быка в дрожжевых митохондриях. Показано, что лимитирующей стадией этого многостадийного процесса 'является встраивание белка во внутреннюю митохондриальную мембрану. В
А.
частности, модифицированная форма пре-цитохрома P450scc с препоследо-вательностью субъединицы IV цитохром с оксидазы дрожжей эффективно импортируется в дрожжевые митохондрии, но только незначительная часть импортированного белка приобретает ферментативно активную форму. Новоимпортированный цитохром P450scc подвергается протеолизу под действием митохондриальной протеиназы Pirn 1р. То или иное нарушение протеолиза ведет к агрегации белка. Как протеолиз, так и агрегация контролируются митохондриальной системой шаперонов - причем оба процесса возможны только после диссоциации цитохрома P450scc от mt-hsp70.
Гибридный белок, в котором 114 N-концевых аминокислотных остатков цитохрома P450scc заменены на адресующую последовательность и трансмембранный участок субъединицы 9 ЬҐ-АТФазьі (pASu9-AP450scc), импортируется в дрожжевые митохондрии и связывается с мембраной таким образом, что полипептидная цепь P450scc развернута и экспонирована в матрикс. ASu9-AP450scc подвергается протеолизу под действием мембранной Ytal0p/Ytal2p протеиназы, причем этот процесс также контролируется митохондриальной системой шаперонов. Последнее обстоятельство предполагает существование некоторого общего механизма удаления из митохондриального матрикса полипептидных цепей неспособных свернуться в третичную структуру и вследствие этого склонных к агрегации, что представляет потенциальную опасность для клетки. При этом участие той или иной протеиназы определяется локализацией полипептидной цепи, подлежащей удалению, а система шаперонов, по-видимому, поддерживает такой полипептид в растворимом виде.
Факт существования хорошо описанных заболеваний, вызванных ошибочным адресованием белков в митохондрии, придает несомненную практическую значимость изучению роли протеиназ в формировании митохондрий и других клеточных органелл.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и одна подана в редакцию. Результаты работы были доложены на IV симпозиуме Химия протеолитических ферментов (Москва, 1997 г.) и на II съезде Биохимического общества Российской академии наук (Пущино, 1997 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит {.о рисунков.
