Введение к работе
Актуальность проблемы
Рецепторы, сопряжённые с G-белками (GPCR), играют ключевую роль в межклеточных биохимических взаимодействиях, отвечающих за управление важнейшими физиологическими процессами, включая сердечную и легочную деятельность, пищеварение и воспалительные реакции, а также восприятие внешних сигналов, таких как свет, звук, запахи. Ключевым аспектом регуляции активности представителей семейства сопряжённых с G-белками рецепторов является их десенситизация, которая достигается в процессе их множественного фосфорилирования под действием протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками (GRK), специфически распознающих и фосфорилирующих только активированные агонистами формы рецепторов. Нарушение регуляции десенсити-зации GPCR в настоящее время связывают с развитием таких патологий, как ночная слепота, хроническая сердечная недостаточность, гипертензия, опиатная зависимость, некоторые виды рака.
9-І-
В большинстве клеток десенситизация GPCR является Са -чувствительным процессом, что является следствием Са -зависимой регуляции
9-І-
активности GRK представителями семейства EF-hand-содержащих Са -связвывающих белков. Так, специфические для фоторецепторных клеток родоп-
9+
синкиназа (GRK1) и GRK7 регулируются нейрональным Са -сеносором реко-верином, в то время как активность других протеинкиназ из семейства GRK (GRK2-6) регулируется универсальным медиатором клеточных сигналов кальция кальмодулином. Интенсивные исследования регуляции десенситизации
9+
GPCR в различных типах клеток показали, что Са -зависимая регуляция GRK является намного более сложным процессом, чем считалось ранее и, в частности, может осуществляться одновременно несколькими Са -связывающими белками. Так, к моменту начала настоящей работы в литературе имелись сведения о том, что присутствующий в фоторецепторных клетках кальмодулин способен связываться с родопсинкиназой Са -зависимым образом. Однако функциональное влияние этого взаимодействия на фосфорилирование родопсина, ка-
тализируемое родопсинкиназой, оставалось неизвестным. В настоящей работе изучались способность кальмодулина регулировать активность родопсинкиназы
9-І-
Са -зависимым образом и структурные основы механизма ингибирования родопсинкиназы кальмодулином, а также участие кальмодулина в совместной с рековерином Са -зависимой регуляции активности родопсинкиназы.
Актуальность настоящей работы состоит в том, что в ней обнаружена новая функция кальмодулина в фоторецепторной клетке, в значительной степени
9-І-
расширяющая понимание механизмов Са -зависимой регуляции фототрансдук-ции.
Цель и задачи исследования
9+
Целью работы являлось изучение роли кальмодулина в Са -зависимой регуляции родопсинкиназы. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:
изучить способность кальмодулина регулировать активность родопсинкиназы Са -зависимым образом; установить участок связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы
исследовать возможность совместной регуляции родопсинкиназы кальмодулином и рековерином
изучить роль кальмодулина во взаимодействии родопсинкиназы с родопсином.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые показано участие кальмодулина в регуляции родопсинкиназы:
9+
продемонстрирована способность кальмодулина Са -зависимо ингибировать родопсинкиназу и определены параметры этого ингибирования. Установлен участок связывания кальмодулина в родопсинкиназе и показано, что участки для связывания рековерина и кальмодулина в молекуле родопсинкиназы не перекрываются. Впервые изучено совместное действие кальмодулина и рековерина на активность родопсинкиназы и экспериментально доказан факт синергизма
9+
в ингибировании родопсинкиназы этими Са -связывающими белками. Впервые идентифицирован участок связывания родопсина в молекуле родопсинкиназы и
показано, что участки для связывания кальмодулина и родопсина в родопсинки-
9+
назе перекрываются. Предложена модель совместной Са -зависимой регуляции кальмодулином и рековерином светозависимого фосфорилирования родопсина под действием родопсинкиназы, основанная на конкуренции между Са -связывающими белками и фотоактивированным родопсином за взаимодействие с родопсинкиназой.
Практическая ценность. Установление механизмов десенситизации зрительного пигмента родопсина в фоторецепторных клетках необходимо для понимания механизмов зрительной трансдукции и выяснения молекулярных механизмов зрения. Полученные результаты имеют большое значение и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка служит удобной моделью для понимания регуляции процесса десенситизации других сопряжённых с G-белками рецепторов, которые являются фармакологическими мишенями для значительного количества используемых в терапевтической практике лекарственных препаратов.
Апробация работы
Материалы диссертации обсуждались на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ и были доложены на заседании кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ. Отдельные аспекты работы представлялись на XXV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2008), 13-й международной конференции по белкам сетчатки (Барселона, Испания, 2008), Европейской конференции по сет-чатке-2009 (Ольденбург, Германия), 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, Россия, 2010), 11-й конференции Европейского кальциевого сообщества (Варшава, Польша, 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 -в рецензируемых научных журналах, отвечающих требованиям ВАК.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка литературы (185 ссылок).
