Введение к работе
Актуальность темы.
В последние 15 лет достигнут значительный прогресс в понимании механизмов регуляции генов по принципу «Quorum Sensing» (QS). QS - система регуляции экспрессии генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с локальной плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /их-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже в 1994 г Greenberg Е.Р. с сотр. (Fuqua W.C., et al 1994). В результате активного изучения было обнаружено, что феномен QS широко распространён среди бактерий. Оказалось, что ряд генов, определяющих вирулентность патогенных микроорганизмов и устойчивость к лекарственным препаратам, регулируется по принципу QS, что имеет особое значение для медицины и поэтому вызывает высокий интерес научного сообщества к данной проблеме.
Zwx-оперон морских бактерий Aliivibrio fischeri в настоящее время принято считать модельным в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, регулятора lux-оперона было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий, а также о механизмах стабилизирующего отбора /wx-оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых регуляторных QS систем у бактерий и исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки. Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики - фолдинг и рефолдинг белков и роль белков - шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются различающиеся по термостабильности, но гомологичные по аминокислотной последовательности бактериальные люциферазы психрофильных и мезофильных морских люминесцирующих бактерий.
Кодируемые генами бактериальных /wx-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсикантов в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых
4 медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.
Цель и задачи исследований.
Целью данной работы являлось изучение механизмов регуляции /их-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, а также исследование роли шаперонов в фолдинге и рефолдинге термолабильных белков на модели различающихся по термостабильности бактериальных люцифераз.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.
Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий,
Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.
Клонировать и секвенировать /wx-опероны бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.
Провести сравнение механизмов регуляции /wx-оперонов психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio.
Определить влияние на активность регуляторного белка LuxR АТФ-зависимых шаперонов и протеаз.
Исследовать роль N- и С-концевых доменов белка LuxR при взаимодействии с шапероном GroEL/ES и протеазой Lon.
Исследовать in vivo воздействие различных шаперонов на рефолдинг белков, различающихся по термостабильности на модели гомологичных бактериальных люцифераз, изолированных из люминесцирующих бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.
Сконструировать и показать эффективность применения /wx-биосенсоров, созданных на основе штаммов Е. coli, содержащих гибридные плазмиды с генами бактериальных люцифераз в качестве репортёрных, расположенных под контролем различных индуцируемых (стрессовых) промоторов.
Научная новизна работы.
Впервые определена структура /wx-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /wx-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена luxR, в /wx-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.
Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.
Впервые показано, что АТФ-зависимая протеаза Lon участвует в негативной регуляции систем QS у морских бактерий. Доказано, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке нативной формы белка LuxR.
Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N -домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином GroEL, необходимым для сборки нативной структуры LuxR.
Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.
Показано впервые, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHsp (IbpAB).
Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.
Сконструированы новые формы /wx-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и супероксид-анион).
Практическая значимость исследования.
Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных специфических /wx-биосенсоров. Использование транскрипционных слияний стрессовых и других индуцируемых промоторов с генами бактериальных люцифераз в качестве репортерных позволило создать набор биосенсоров, специфически реагирующих на различные токсиканты и другие биологически активные вещества. Данные биосенсоры в
настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, тестированию медицинских препаратов и для изучения механизмов воздействия на клетку различных токсикантов.
Полученные в работе данные о влиянии шаперонов и протеаз на активность белка LuxR могут быть использованы для создания более чувствительных биосенсоров для детекции аутоиндукторов первого типа. А также бактериальные люциферазы в настоящее время используются в качестве модели для изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.
Апробация работы.
Материалы работы были представлены и обсуждались на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (16th ISBC April 19-23, 2010, Lyon, France), III съезде Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2001), Объединенном Съезде генетиков и селекционеров России, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, и Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров.. (ВОГИС с 21 по 28 июня 2009 г. Москва), конференции европейского биохимического общества (FEBS-IUBMB-2005 Conference in Budapest, Hungary) и других конференциях и семинарах. Диссертационная работа была апробирована на секции «Генетика микроорганизмов» Диссертационного совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 24 мая 2011 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 статья в рецензируемых журналах.
Структура диссертации.
Диссертационная работа включает 6 глав, 151 страницу, 58 рисунков и 4 таблицы. В работе использовано 208 литературных источников.
