Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время представляет интерес исследование обширного семейства психрофильных бактерий. Оптимальная температура роста для психрофильных бактерий 10-15С. Психрофильные бактерии способны расти при 4 С, но не растут при температуре выше 30С, в отличие от мезофильных бактерий, которые не растут при 4С и растут при 30С и выше. Среда обитания психрофильных бактерий, как правило, холодные воды морей Арктики и Антарктики.
В настоящей работе в качестве психрофильных бактерий используются морские светящиеся бактерии вида Aliivibrio logei. Бактерии данного вида были нами изолированы в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей.
Психрофильные бактерии вида A. logei уникальны, так как помимо основных свойств, характерных для психрофилов, они содержат в своем геноме гены /г/х-оперона, определяющие способность бактерий люмннесцировать. Предполагается, что регуляция экспрессии /ux-генов определяется системой типа "Quorum Sensing'XQS), являющейся основной регуляторной системой для многих мезофильных бактерий, в том числе патогенных для человека, животных и растений.
QS- система регуляции, определяет экспрессию группы генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /га-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже, в 1994 г (Fuqua W.C., et al 1994).
іих-оперон морских бактерий A. fischeri является базовым в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, активатора транскрипции генов /га-оперона, было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов: 1) об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий; 2) о механизмах стабилизирующего отбора /ых-оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых вариантов QS систем у бактерий, а также исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки.
В настоящей работе проведено исследование регуляции экспрессии /га-генов у изолированных штаммов A. logei. Впервые показано, что экспрессия /zct-генов у этих бактерий осуществляется системой QS.
Кодируемые генами бактериальных йа-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсических веществ в окружающей среде и в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.
Цель и задачи исследований.
Целью данной работы являлось изучение структуры /их-оперона и механизмов регуляции экспрессии генов /шг-оперонов морских люминесцирующих психрофильных бактерий A. logei.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий,
Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.
Клонировать и секвенировать /шг-опероны бактерий.
Провести сравнение механизмов регуляции экспрессии /шншеронов
психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio. " Проверить влияние генов «холодового шока» на экспрессию /іа-генов A. logei в клетках Е. coli
Научная новизна работы.
Анализ видовой принадлежности люминесцирующих штаммов бактерий изолированных в акваториях северных морей, показал широкое распространение морских психрофильных бактерий вида A. logei в акватории северных морей (Белое, Охотское, Берингово моря).
Впервые определена структура /их-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий A. logei. В отличие от /шг-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена liixR, в /шг-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как
по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.
Доказано, что криптическая люминесценция патогенных для лососевых рыб морских бактерий Alihibrio salmonicida (бактерии лю.чинссцируют лишь при добавлении в среду субстрата люинферазы длишюцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.
Показано, что для эффективной экспрессии luxCD генов A. logei в клетках Е. coli необходим ген «холодового шока» cspA, отвечающий за синтез РНК-шаперона.
Практическая значимость исследования.
Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных 1га-биосенсоров для определения интегральной токсичности. В работе впервые было проведено сравнение различающихся по термостабильности люцифераз из /шг-оперонов морскігх светящихся бактерий Photobacterium leiognalhi, A. logei КСЫ и наземных энтомопатогенных бактерий Photorhabdus luminescens ZM1 с точки зрения возможностей определения общей (интегральной) токсичности.
Использование транскрипционных слияний индуцируемых промоторов (чувствительных к аутоиндукторам (АИ) первого типа) психрофилышх бактерий, с генами термостабильных бактериальных люцифераз, в качестве репортерпых, позволило создать высокочувствительные, специфически реагирующие на АИ первого типа биосенсоры. Данные биосенсоры в настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, определению интегральной токсичности наноматериалов. Разрабатываются методики диагностики инфекций, обладающих системами регуляции типа QS в биологических образцах, и в образцах, собранных с потенциально-инфекционных поверхностей, в частности, с медицинского оборудования, посуды и других потенциальных распространителях внутрибольничных инфекций.
Структура работы.
Диссертация изложена на ЗО листах машинописного текста, включая л О рисунков \л таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает VZO работ отечественных и зарубежных авторов.
Апробация работы.
Материалы исследования по теме диссертации докладывались на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» в 2008 г, на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г, на XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» в 2010г, на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции в 20 Юг, Лион, Франция.
Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 06 октября 2011 г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК.
