Содержание к диссертации
Введение
1. Экологические и таксономические основы скрининга бактерий, способных утилизировать нитрилы 26
1.1. Таксономическое разнообразие изолятов 27
1.2. Анализ путей утилизации нитрилов у отобранных изолятов 28
2. Бактериальный штамм м8: общая характеристика и особенности катаболизма нитрилов 31
2.1. Общее описание штамма 31
2.2. Свойства нитрилгидратазной активности штамма Я. гкоёосИгош М8 37
2.3. Физико-химические и каталитические свойства амидазы из Я. гкоёосигош М8 39
3 . Генетический контроль катаболизма нитрилов у я. яиооосияош М8 А 45
3.1. Разработка систем клонирования и переноса генов для Якойососсш 8рр 45
3.2. Исследование локуса хромосомы Я.ткойосктош М8, контролирующего утилизацию нитрилов 52
3.3. Экспрессия клонированного гена НГ. .62
3.4. Выделение и свойства мутантов с измененной способностью утилизировать нитрилы 63
4. Механизмы регуляции катаболизма нитрилов у я.гьойосьгош М8 67
4.1. Амид-зависимая индукция синтеза НГ и АМ 67
4.2. Кобальт-зависимая регуляция НГ активности в я.гьосьгош М8 70
4.3. Углеродная катаболитная репрессия метаболизма нитрилов у Я.ткойосктош М8 73
4.4. Роль ионов аммония в регуляции метаболизма нитрилов у Я.гко4осИгош М8 .81
5. Промышленное использование нитрилутилизирующих бактерий. 85
5.1. Создание биокатализаторов на основе штамма Я.ткойосктош М8 85
5.2. Получение акриламида с помощью биокатализа .92
5.3. Бйокаталитический метод получения никотинамида 100
Заключение 104
Выводы 106
Литература 108
- Анализ путей утилизации нитрилов у отобранных изолятов
- Свойства нитрилгидратазной активности штамма Я. гкоёосИгош М8
- Исследование локуса хромосомы Я.ткойосктош М8, контролирующего утилизацию нитрилов
- Кобальт-зависимая регуляция НГ активности в я.гьосьгош М8
Введение к работе
Актуальность проблемы
В основе современных методов получения разнообразных синтетических соединений лежат каталитические процессы, которые, как правило, проводят при высоких температурах и давлении в присутствии сложных гетерогенных катализаторов. Использование в качестве катализаторов клеток микроорганизмов или их ферментов позволяет осуществить такие процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) с высокой селективностью и специфичностью. В отличие от традиционных катализаторов, биокатализаторы способны также осуществлять стереоселективные и регеоселективные реакции. Таким образом, биокаталитические процессы формируют новый облик химии, основанной на энергосберегающих, безотходных и экологически безопасных технологиях. Однако, в современной химической индустрии использование биокатализа все еще ограничено. Во многих случаях биокаталитические процессы неспособны конкурировать с традиционными технологиями по уровню себестоимости продукта. Большой прогресс в области изучения структуры и функций ферментов, массовое секвенирование геномов бактерий, успехи метаболической инженерии, исследование микробного биоразнообразия, развитие новых методов направленной эволюции позволяют надеятся, что биотехнологии все шире будут внедрятся в химическую промышленность, способствуя становлению новой отрасли- «зеленой химии».
Идеи о возможности использования в качестве биокатализаторов ферментов (нитрилгидратаз и нитрилаз), участвующих в метаболизме нитрилов, бьши высказаны уже в первых работах, посвященных изучению нитрилутилизирующих бактерий (в начале 70 годов). Первой реализовала эту идею компания Нитто (Япония), создав производство акриламида, основанное на биокатализе. В качестве биокатализаторов были использованы бактериальные штаммы -Corynebacterium (Rhodococcus) sp. N-774 и Pseudomonas chlor or aphis В-23, обладающие нитрилгидратазной активностью (Watanabe et al.,1987; Asano et al.,1982). Несмотря на значительные преимущества биокаталитического метода по сравнению с традиционными химическими технологиями, используемые биокатализаторы, обладали рядом недостатков: их активность ингибировалась акриламидом и, как следствие этого, с их помощью удавалось получать в промышленных условиях растворы, содержащие не более 27% акриламида. Для получения товарной формы (40-50% растворы) требовалась стадия концентрирования. Кроме того, биокатализаторы обладали достаточно высокой активностью амидазы, функционирование которой приводило к накоплению акриловой кислоты, что ухудшало качество получаемого акриламида.
Для совершенствования параметров биотехнологического процесса требовалось создание биокатализаторов нового поколения, лишенных указанных недостатков. Мы полагали, что эта задача может быть решена с помощью широкого поиска новых нитрилгидратаз с уникальными свойствами и изучения механизмов, контролирующих синтез нитрилгидратаз в клетках бактерий.
Настоящая работа обобщает результаты изучения бактерий, обладающих нитрилгидратазной активностью и является первым примером комплексного исследования метаболизма нитрильных соединений у родококков на генном и клеточном уровне.
Цель и задачи исследования
Основной целью настоящей работы было изучение механизмов регуляции метаболизма нитрилов у Ккойососсиз гкойоскгоиз и на этой основе развитие новых биокаталитических процессов с использованием ферментов, участвующих в утилизации нитрильных соединений.
В соответствии с этим в работе решались следующие задачи:
1. Создание представительной коллекции нитрилутилизирующих бактерий. Выбор штамма с нитрилгидратазной активностью, обладающего потенциалом для промышленного использования.
2. Изучение ключевых ферментов метаболизма нитрилов - нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ) у штамма К.гко(1оскгои5 М8, обладающего высоким потенциалом для промышленного использования. Идентификация и характеристика основных механизмов регуляции синтеза НГ и АМ.
3. Разработка системы генетического анализа для родококков.
4. Изучение генетического контроля утилизации нитрилов у К.гкос1оскгоиз М8.
5. Разработка стратегии повышения НГ активности и создание промышленных биокатализаторов для получения акриламида на основе штамма Кгкойоскгоиз М8.
6. Разработка биокаталитических процессов получения амидов, прежде всего, акриламида и никотинамида.
Научная новизна и практическая ценность работы. в работе впервые получены следующие результаты:
1. Показано, что бактерии рода Кко(1ососсиз составляют самую многочисленную группу (свыще 50%) среди нитрилутилизирующих бактерий, изолированных из разных биогеоцинозов.
2. Продемонстрирован коньюгативный перенос плазмид между щтаммами Е.соИ и Шойососсиз 5рр., что позволило создать серию мобилизуемых векторов, способных либо авнономно реплицироваться в родококках ( за счет уникального репликона криптической плазмиды) либо интегрировать в хромосому с помощью интегративной системы актинофага фС31 или за счет гомологичной рекомбинации.
3. Для бактерий рода Кко Лососси8 разработаны оригинальные методы клонирования генов, введения их в клетки разных видов родококков, интеграции генов в хромосому, замещения аллелей гена в хромосоме и их инактивации.
4. Осуществлено клонирование и проведен структурно-функциональный анализ локуса хромосомы штамма М8, контролирующего катаболизм нитрилов. Показано, что его главной особенностью является отсутствие оперонной организации: гены НГ, АМ и регуляторные гены представляют собой единый регулон, обеспечивающий индуцибельное координированое образование двух ферментов НГ и АМ, вовлеченных в деградацию нитрилов.
5. Обнаружен принципиально новый механизм регуляции НГ, заключающийся в активации транскрипции гена НГ ионами кобальта, входящими в состав простетической группы фермента.
6. Показано, что синтез ферментов утилизации нитрилов в штамме М8 подвержен глюкозной репрессии, тем самьм, впервые продемонстрировано наличие у родококков углеродной катаболитной репрессии. Отсутствие в штамме М8 фосфотрансферазной системы для транспорта Сахаров, а также отсутствие эффекта сАМФ на репрессию продемонстрировало, что механизмы катаболитной репрессии у родококков отличаются от таковых у энтеробактерий и бацилл.
7. Получены доказательства, что синтез ферментов НГ и АМ в штамме К.гкойосНгоиз М8 подвержен сложной регуляции на транскрипционном уровне, элементами которой являются: координированная индукция обоих ферментов, вызываемая амидами; кобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и репрессия аммонием.
8. Изучены пути ассимиляции аммония в штамме К.гко(!оскгоиз М8. В зависимости от концентрации аммония, в клетках М8 преимущественно функционирует либо
путь с участием глутаматдегидрогеназы - при высоких концентрациях аммония либо с участием глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы -при низких конце нтр ациях.
9. Разработан селективный способ получения мутантов по метаболизму нитрилов и впервые получены мутанты с конститутивным синтезом НГ и AM. Практический аспект работы связан с созданием биокатализаторов и разработкой на их основе процессов получения амидов, в первую очередь, акриламида. Биокатализатор МЗЗ, созданный в настоящей работе, по уровню активности превышает все известные в мире аналоги. Разработанный на основе МЗЗ биотехнологический способ получения акриламида выгодно отличается от традиционных химических способов- сернокислотного и каталитического, высокой степенью селективности и конверсии гидратации акрилонитрила, мягкими условиями проведения процесса, чистотой получаемого продукта, низкими энергетическими затратами, экологической безопасностью. В настоящее время с помощью биокатализатора МЗЗ в России и в Южной Корее поизводится несколько тысяч тонн акриламида в год. Вся питьевая вода г. Москвы очищается с помощью флокулянтов, получаемых на основе биоакриламида, произведенного с использованием биокатализатора МЗЗ. Биокаталитический процесс получения акриламида является первым в России примером использования биотехнологии в крупнотоннажной химии.
Работа по созданию биокатализаторов и развитию технологии получения акриламида и полимеров на его основе была отмечена приемией Правительства России в области науки и техники за 1994 г.
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов в лаборатории генетики биодеградации в соавторстве с Астауровой O.A., Герасимовой Т.В., Лариковой Г.А., Погореловой (Леоновой) Т.Е., Поляковой И.Н., Пауковым В.Н., Рябченко Л.Е., Новиковым А.Д., Гордеевым В.К., Синеокой И.В., Акопянц К.Э., Кирсановым Н.Б., Мысловатой М.Л. Часть работы выполнялась в кооперации с сотрудниками лабораторий ГосНИИгенетика (заведующие: Вейко В.П., Честухина Г.А., Воейкова Т.А., Глазунов A.B.), с сотрудниками Саратовского филиала ГосНИИгенетика (ныне «Биоамид») Ворониным СП., Козулиным СВ., сотрудниками кафедры почвенной микробиологии МГУ Добровольской Т.Г. и Скворцовой И.Н, а также отдела микробиологии окружающей среды Национального центра по биотехнологии (Брауншвайг, Германия) К.Тимиссом и П.Голышиным. Всем коллегам автор выражает благодарность за участие в проведении представленного к защите исследования. Автор выражает признательность чл.-корр. РАН, профессору В.Г. Дебабову за постоянный интерес, плодотворные дисскуссии и поддержку данной работы.
Апробация работы
Диссертационная работа была апробирована на семинаре отдела молекулярной генетике ГосНИИгенетика в 2001 г. Материалы диссертации докладывались на отечественных и зарубежных конференциях, симпозиумах и семинарах, в том числе: на 7 Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); 5 Форуме по прикладной биотехнологии (Рент, Бельгия, 1991); 5 конференции по генетике и молекулярной биологии промышленных микроорганизмов Американского микробиологического общества (Блюмингтон, 1992); Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Москва, 1994); 9 и 11 Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Москва, 1994; Сисси, Греция, 1999); 10 Международном биотехнологическом симпозиуме (Сидней, 1996); 8 Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов (Иерусалим, 1998); Международном семинаре "Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium" (Новосибирск, 1999); Кремлевском инвестиционном форуме "Продукция и технологии: продвижение на рынок" (Москва, 2000); Конференции по биодеградации и биокатализу Американского микробиологического общества (Сан Хуан, 2001).
Анализ путей утилизации нитрилов у отобранных изолятов
На следующем этапе у отобранных изолятов были изучены пути утилизации нитрилов. Как известно, начальные этапы утилизации нитрилов могут проходить по двум путям с участием различных ферментных систем (Bunch, 1996). Первый путь-это одностадийное превращение нитрилов в кислоты и аммоний, с участием фермента нитрилазы. Второй путь -это двухстадийное превращение с образованием амидов и их последующим превращением в кислоты и аммоний с участием ферментов нитрилгидратазы и амидазы, соответственно. По первому nyivi. преим)тдественно метаболизируются ароматические и гетероциклические нитрилы, а по второму алифатические нитрилы.
Для идентицикации ферментных систем утилизации нитрилов у новых изолятов (около 60 штаммов), на первой стадии был изучен их рост на 4 субстратах-ацетонитриле и ацетамиде (алифатические соединения) и бензонитриле и бензамиде (ароматические соединения). Затем, клетки, выросшие на ацетонитриле, были использованы для трансформации акрилонитрила. Промежуточные продукты трансформации -акриламид и акриловая кислоты тестировались с помощью газовой хроматографии.
Все изоляты, отобранные на ацетонитриле (AN серия), росли и на ацетамиде (Табл.4). Почти все изоляты этой серии трансформировали акрилонитрил и накапливали акриламид. Более того, большинство изолятов этой серии не росли на бензонитриле и бензамиде. Все это указывало на наличие у этих изолятов ферментов -нитрилгидратазы и амидазы.
В отличие от изолятов первой серии, изоляты, отобранные на бензонитриле (серия BN), не росли на бензамиде (за исключением одного штамма BN17) [Табл.5].
Все штаммы росли на ацетонитриле и большинство из них слабо росло на ацетамиде. Только один изолят, ВМб, рос на нитрилах, но не на амидах, и при трансформации акрилонитрила образовывал акриловую кислоту. Вероятно, что этот штамм обладал нитрилазной активностью и не содержал нитрилгидратазы. Еще 7 штаммов не образовывали при трансформации акриламида, однако они были способны рости на ацетамиде. По-видимому, эти штаммы помимо нитрилазы содержат амидазу. Остальные штаммы ( 14 из 26) при трансформации акрилонитрила продуцировали и акриламид и акриловую кислоту, что означало, что они обладали двумя ферментными системами-нитрилазой и нитрилгидратазой/амидазой.
Таким образом, в результате скрининга бьша создана большая коллекция бактериальных штаммов (свыше 100 штаммов), способных рости на различных нитрилах (как алифатических, так и ароматических) и обладающих нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностями. Использование разных нитрилов в качестве единственного источника азота в обогатительных средах позволяло преимущественно отбирать бактерии с определенным набором ферментов. Изолированные штаммы были отнесены к 6 таксонам. Подавляющее число штаммов, растущих на нитрилах, составляли родококки. Созданная коллекция была использована для поиска штаммов, обладающих ферментами с уникальными свойствами.
Свойства нитрилгидратазной активности штамма Я. гкоёосИгош М8
Представленные ниже результаты о свойствах нитрилгидратазы были получены на интактньпс клетках М8.
Клетки М8 обладали высоким уровнем активности при рНб.О - 8.0, а при хранении в буфере сохраняли НГ активность в течении 24 час в широком интервале значений рН (от ЗдоЮ).
Максимальный уровень НГ активности наблюдался при 55 "С (Рис.14). Клетки М8 сохраняли НГ активность при вьщерживании в 10 мМ фосфатном буфере в широком интервале температур от 4 до 37 С в течении 15 час.
Суспензию клеток выдерживали при разных температурах в фосфатном буфере, рН7.6 в течении 2 час. Через каждые 30 мин отбирали пробы и определяли НГ активность в стандартном тесте при 20 С.
Asanoetal.,1982 Watanabe et al., 1987 Nagasawa et al. 1991 Payneetal.,1997 Yamakietal., 1997 Pereira et al., 1998 использованы интактные клетки СА) и изолированные ферменты.
Активность клеток в стандартном тесте с акрилонитрилом как субстратом была принята за 100%. Для сравнения представлены данные для штаммов Р.сМогогарЫз В23 (Nagasawa е1 а!., 1989), Ккос1ососси5 5р. N774 (Watanabe еГа!., 1987), К.гко(1оскгоизЛ, Н- НГ (Nagasawa еГ а1., 1991).
Из представленных данных видно, что НГ из штамма М8 отличается от известных ИГ и способна использовать в качестве субстратов как алифатические, так и гетероциклические и ароматические нитрилы.
Таким образом, НГ активность штамма М8 обладает комплексом уникальных свойств: высокой рН- и термостабильностью, а также широкой субстратной специфичностью.
Свойства амидазной активности были изучены на интактных клетках и на чистом ферменте, который был изолирован из мутантного штамма М50 (производного штамма М8), синтезирующего конститутивно амидазу в больших количествах (раздел 3.3).
Используя фракционное осаждение изопропиловым спиртом, из гомогената клеток удалось получить обогащенный белковый препарат с высоким выходом и 20-кратной степенью очистки (Табл.8). С помощью высокоскоростной хроматографии на анионообменнике Мопо Р из обогащенного препарата вьщелена фракция, содержащая фермент, гомогенный по данным ЭФ в ПААГ.
Очищенный фермент обладал двумя активностями-гидролитической и трансферазной, что характерно для всех изученных амидаз, вовлеченных в метаболизм нитрильных соединений (Founand & Arnaud, 2001). Амидаза из М8 катализировала гидролиз амидов и перенос ацильной группы на гидроксиламин, согласно уравнениям (1) и (2):
Активность определена по трансферазной реакции. За единицу активности принято такое количество фермента, которое при 37АС за 1 мин образует 1 мкмоль продукта.
С помощью ЭФ в 808-ПААГ и гель-фильтрации на Суперозе 12 было показано, что амидаза имеет молекулярную массу 150±20 кОа и состоит из 4-х одинаковых субъединиц с молекулярной массой 42±2 кОа.
Все известные амидазы состоят из идентичных субьединиц, размер и число которых варьирует в широком интервале. Наиболее схожей по размеру и числу субъединиц является амидаза из Вгеу1Ьас1егшт зр. КЗ 12 (8оиЬг1ег е1 а1., 1992), состоящая из 4 субъединиц с Мг 43000. Близкими размерами субъединицы характеризуются и алифатическая амидаза из Р. aeruginosa (Mr 6 х 38400) (Ambler et al., 1987). Интересно отметить, что два нитрилутилизирующих штамма R. rhodochrous - М8 и Л, содержат схожие кобальт-зависимые НГ и разные амидазы. Амидазы из штамма R. rhodochrous М8 ч оказалась почти на 150 аминокислотных остатков меньше амидазы из Л (Kobayashi et al., 1993).
Аминокислотный состав амидазы продемонстрировал некоторое превышение содержания кислых остатков над основными. Подобное соотношение характерно и для амидазы из Р. aeruginosa (Ambler et al., 1987), содержаш:ей в 1,5 раза больше кислых остатков. Содержание гидрофобных остатков, формирующих ядро этих ферментов, также сходно.
Температурный оптимум действия амидазы лежит в диапазоне 55-60С (Рис.18). При 37С фермент проявляет лишь 34% максимальной активности.
Амидаза активна в достаточно широком диапазоне рН-от 5 до 8 (рис.17). За пределами этих значений рН наблюдается резкое снижение активности. Так, при рН около 3,7 и 8,5 фермент проявляет лишь 50% своей активности.
Отметим, что, несмотря на различный субъединичный состав и срецифичность, практически все амидазы наиболее активны при достаточно высоких температурах - около 55С (Мае81гасс1 еХ а1., 1988). Исключение составляет пептид-амидаза из 81епоГгоркотопаз такгоркИа (81е1ке5-К1!1ег оХ а1., 1995), обладающая максимумом активности при 39-45С. Однако этот фермент и по некоторым другим характеристикам отличается от группы рассматриваемых гидролаз.
Фермент полностью ингибировался ионами тяжелых металлов - характерными реагентами на сульфгидрильную группу (Табл.9). Кроме того, его активность полностью подавлялось в присутствии ионов РЬЛ! ". Комплексоны - ЭДТА и о-фенантролин не влияли на активность. Очевидно, исследуемый фермент не является металлозависимым. Ингибиторы сериновых протеиназ (РМ8Р и 01РР) также не ингибируют фермент. В то же время, в присутствии ОРТ активность фермента увеличивается в 1,5 раза. Полученные данные свидетельствуют о важной роли сульфгидрильных групп в механизме действия фермента. Наличие существенной для катализа 8Н-группы подтверждается практически всеми исследователями вне зависимости от источника, свойств и специфичности изучаемых ими амидаз (исключение составляют амидазы из СогупеЬас1епит зр. С5
Исследование локуса хромосомы Я.ткойосктош М8, контролирующего утилизацию нитрилов
Клонирование фрагмента хромосомы М8, контролирующего утилизацию нитрилов проводили в два этапа: на первом этапе был клонирован структурный ген ИГ, а затем, используя ген ИГ как зонд, были клонированы фланкирующие области.
3.2.1. Клонирование НГлокуса из хромосомы R.rhodochrous М8
НГ из R. rhodochrous М8 была изолирована и очищена до гомогенного состояния в Саратовском НИИ Биокатализа, что позволило определить N-концевые аминокислотные последовательности ее а и субьединиц (Синолицкий и др., 1997). Эти сведения были использованы для синтеза праймеров для получения НГ из хромосомы R. rhodochrous М8 путем PCR амплификации. Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента бьша зарегестрирована:в EMBL под номером Х86737.
Схема клонирования участков хромосомы М8, фланкирующих гены НГ, основывалась на использовании плазмиды pRYl, не способной реплицироваться в щтамме М8. Мы обнаружили, что включение в состав pRYl гена НГ приводило к интеграции плазмиды в хромосому после ее введения к клетки М8. Следующие факты свидетельствовали, что интеграция происходила в ген НГ. Все иззАенные Tsr A трансконьюганты (свыше 500 клонов) утрачивали активность НГ, но сохраняли амидазную активность. В том случае, если ген НГ вводился в штамм М8 в составе плазмиды pTOl (pRYlOO), способной интегрировать в хромосому с помощью int системы фага фс31, то TsrA трансконьюганты сохраняли активность НГ. Прямым доказательством того, что интеграция плазмид происходила в ген НГ были результаты гибридизационного анализа хромосомы М8 и трансконьюгантов (Рис.21). В качестве меченой пробы использовали 1.3 тпн фрагмент ДНК, содержащий ген НГ. Так как ген НГ не содержал сайтов для EcoRI, то среди EcoRI фрагментов хромосомы М8 (Рис.21, дор. 1) только один фрагмент (5.2 тпн) мог гибридизоваться с меченой пробой. В случае Tsr трансконьюганта ( Рис.21, дор.2), меченая проба гибридизовалась с двумя EcoRl- фрагментами хромосомы (5.2 и 3.5 тпн ), причем сумма этих фрагментов точно совпала с суммой фрагмента хромосомы М8, содержащего гены НГ и плазмиды pRYl-НГ (6.6 тпн). Мы заключили, что появление двух копий НГ гена в хромосоме трансконьюганта является следствием интеграции плазмиды за счет гомологичной рекомбинации, согласно схеме, преведенной на Рис.22. В этом случае плазмида pRYl-НГ, интегрированная в хромосому, оказывается фланкированной копиями НГ гена. 8,3 5,2 его Рзт А трансконьюганта с геном НГ, меченым РАА. ГАсоК! фрагменты хромосомы М8; 2 - соК1 фрагменты хромосомы трансконьюганта; 3-1.3 тин фрагмент ДНК, содержащий структурные гены НГ. НГ
Удобное расположение сайтов на плазмидной ДНК обеспечивало возможность вырезания плазмиды из хромосомы с фланкирующими ее участками. Процедура клонирования областей, фланкирующих НГ, включала следующие этапы (Рис.22):
1. Включение в состав плазмиды pRYl фрагмента хромосомы М8 для создания области гомологии между плазмидой и хромосомой. В качестве гомологичного фрагмента использовался структурный ген НГ и другие участки НГ кластера хромосомы М8.
2. Перенос плазмид с фрагментом хромосомы М8 в штамм М8 и отбор Tsr A трансконьюгантов, которые содержали плазмиду, интегрированнзлю в хромосому.
3. Вьвделение хромосомной ДНК из трансконьюгантов и вьфезание из хромосомной ДНК плазмид с фланкирующими областями с помощью рестриктаз EcoRl, Sacl, Kpnl. Лигирование.
4. Трансформация Е. coli и отбор Амр А транформантов. Анализ плазмидной ДНК из Амр А клонов трансформантов и отбор плазмид с фрагментами хромосомы М8.
Для клонирования областей предшествующих гену НГ использовалась плазмида pRY213. С ее помощью были получены плазмиды pRY20, 26 и 36, содержащие гены НГ и EcoRl-, Kpnl- или Socl- фрагменты хромосомы перед геном НГ (Рис.23). С помощью плазмиды pRY207 были получены плазмиды pRY13, 5 и 11, которые содержали фрагменты хромосомы М8 за геном НГ (Рис.23). Хромосома М8
Стратегия секвенирования включала субклонирование небольших перекрывающихся фрагментов и определение их нуклеотидных последовательностей. Работа по секвенированию все еще продолжается и к настоящему времени определена полная нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК длиной 6061 п.н., начиная с Xhol сайта (принят за «О» точку на рис.23)
Компьютерный анализ позволил обнаружить на исследуемом фрагменте ДНК несколько открытых рамок считывания (ORF), две из которых соответствовали генам двух субъединиц НГ. Структурный ген бета-субъединицы (обозначенный nhmB) имел протяженность 690 нуклеотидов и кодировал пептид длиной 230 аминокислот. Ген альфа- субьединицы (nhmA) начинался через 13 нуклеотидов от nhmB и кодировал пептид размером 204 аминокислоты. Расчетная масса двух субъединиц составляла 26.3 и 22.8 кОа, что соответствовало массам субъединиц, рассчитанным на основании электрофоретического анализа. Введение мутации в ген бета-субъединицы НГ (пктВ) путем замещения интактного гена в хромосоме М8 на мутантную копию приводило к потере НГ активности (Рис.24).
Кобальт-зависимая регуляция НГ активности в я.гьосьгош М8
При оптимизации условий культивирования штамма R. rhodochrous М8 было обнаружено, что индукция НГ происходит только в присутствие ионов кобальта в ростовой среде (Табл.15). При этом амидазная активность культуры практически не зависила от ионов кобальта. Таким образом, для индукции НГ в штамме М8 требовались индуктор и ионы кобальта. В мутанте М28, синтезирующем НГ и АМ в отсутствие индуктора, уровень НГ активности зависел только от ионов кобальта (Табл.15). Этот факт свидетельствовал, что индуктор и ионы кобальта действуют на разные мишени.
Ионы других металлов - Ре, С Мп, 2п, Си, Мо не оказывали влияния на индукцию НГ и АМ в клетках М8.
Следует отметить, что ионы кобальта повышали НГ активность только в том случае, если их добавляли к растущей культуре М8. Добавление ионов кобальта к культуре, предварительно выращенной на среде без кобальта, не приводило к повышении НГ активности.
Таблица 15. Влияние ионов кобальта на НГ и АМ активности штамма R. rhodochrous М8 и его конститутивного мутанта М28.
Образование НГ и АМ в клетках М8 и его конститутивного мутанта М28 было изучено с помощью 8Э8-ПААГ электрофореза (рис.31). Два полипептида (около 29 и 26 кЭа), соответствующие двум субьединицам НГ отсутствовали в клетках М8, выращенных без индуктора или без ионов кобальта (дор.2 и 3). Эти полипептиды также не выявлялись в клетках мутанта М35 не способного синтезировать нитрилгидратазу и амидазу (дор.1). В клетках конститутивных мутантов уровень содержания этих полипептидов зависил только от ионов кобальта в среде.Образование амидазы в клетках щтамма М8 (дор.З и 4) и его мутанта М28 (дор.З, 5 и 6) не зависело от ионов кобальта, что хорощо согласуется с данными по уровню АМ активности при разных условиях культивирования (Табл.15). Таким образом, в отсутствие ионов кобальта в щтамме М8 не наблюдался синтез НГ. 66, 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 31. SDS-ПААГ-электрофоретический анализ суммарных клеточных белков R.rhodochrous М8 и его мутантов М28 и М35, выращенных в разных условиях. / - мутант М35, выращенный на среде с мочевиной (0,02 М), глюкозой (0,03 М) и ионами кобальта; 2 - штамм М8, выращеный на среде с глюкозой (0,03 М), NH4CI (0,03 М) и ионами кобальта; 3- и 4 - штамм М8, выращенный на среде с глюкозой (0,03М), мочевиной (0,11 М) без кобальта и в присутсвии ионов кобальта, соответственно; 5- и 6- мутант М28, выращенный на среде с пируватом натрия (0,03 М), NH4CI (0,01 М) без кобальта и в присутсвии ионов кобальта, соответственно. Ионы кобальта добавлены в виде CoCh 6Н2О (0,004 г/л). Содержание белка в образцах 50 мкг. 7 -НГ, выделенная из М8. Молекулярная масса маркерных белков указана слева в кДа.
Анализ с помощью Нозерн-гибридизации содержания специфической нитрилгидратазной мРНК в клетках, выращенных в условиях избытка или дефицита ионов кобальта позволил выявить регуляторную роль ионов кобальта в экспрессии генов нитрилгидратазы у Я. гИоёосИгош М8 (Рис.32). При культивировании щтамма М8 в среде, содержащей только индуктор (дор. 2 и 6-8) или ионы кобальта (дор. 10), уровень транскрипции гена НГ был очень низким. Добавление ионов кобальта к культуре М8, растущей на среде без СоСЬ, приводило к повыщению уровня транскрипции. Уже через 4 часа после добавления кобальта (дор. 3) мы наблюдали значительное (не менее чем в 10 раз) повышение уровня мРНК генов нитрилгидратазы, сохраняющееся до стационарной фазы роста (на протяжении 24 час.) (дор. 3-5). Аналогичные результаты были получены для конститутивного штамма М28 (данные не показаны).
Нозерн-блоттинг анализ транскрипции генов НГ в клетках К. гкос1оскгоиз М8, выращенных в присутсвии и без ионов кобальта. Тотальная мРНК выделена из клеток К. гкойосНгоиз М8, выращенных на среде МС с глюкозой (0,03 М) и мочевиной (0,11М): 1 и 9 - в присутствии ионов кобальта (0,004 г/л) в течении 24 и 48 час, соответственно; 2 и 68 - без ионов кобальта в течении 24, 28, 31 и 48 час, соответственно; 3-5 - в течении 24 час без ионов кобальта, затем с добавлением СоСЬ и последующим культивированием в течении 28, 31 и 48 час, соответственно; 10 -штамм М8 культивировали на среде с глюкозой (0,03 М) и хлоридом аммония (0,03 М) в присутствии ионов кобальта. Содержание тотальной мРНК в образцах 5 мкг. Положение 168 и 238 рРНК и их размеры в т.п.н. указаны слева.
Таким образом, низкий уровень НГ активности клеток К. гкослоскгоиз М8, выращенных без ионов кобальта, обусловлен слабой экспрессией генов НГ. Ионы кобальта, непосредственно или взаимодействуя с каким-либо регуляторным беоком, способны регулировать транскрипцию генов НГ в клетках К. гко(1оскгоиз М8. Подобный механизм регуляции известен для генов устойчивости к ионам ртути (Не1тапп е! а1.,1989). Отличие состоит в том, что ионы ртути Я1:ляются токсичным для клетки агентом, в то время как ионы кобальта входят в состав регулируемого им фермента.
Кобальт-зависимая регуляция экспрессии гена НГ в клетках М8 является уникальным примером специфической регуляции синтеза внутриклеточных ферментов на транскрипционном уровне с помощью ионов металлов, которые входят в состав простетической группы фермента. Такия регуляция позволяет заблокировать синтез НГ уже на ранней стадии и предотвратить накопление неактивного белка в клетке, что особенно важно для клеток в естественных природных условиях, где ионы кобальта присутствуют в лимитированных количествах.
Таким образом, НГ из R.rhodochrous М8 является кобальт-зависимым ферментом. К настоящему времени, помимо М8, известно еще два щтамма R. rhodochrous Л и Pseudomonasputida 5В (Nagasawa et al., 1991; Payne et al., 1997), содержащих кобальт- зависимые НГ. В то же время в литературе имеются многочисленные примеры выделения железо-зависимых НГ (ВшюЬ, 1996). Результаты, проводимого нами скрининга нитрилутилизирующих бактерий также подтвердили факт редкой встречаемости кобальт- содержащих НГ: среди 100 независимо изолированных из природных источников нитрилутилизирующих штаммов нам удалось обнаружить только один штамма с кобальт- зависимой НГ активностью.
