Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот Крючкова, Полина Николаевна

Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот
<
Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Крючкова, Полина Николаевна. Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10 / Крючкова Полина Николаевна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова].- Москва, 2010.- 117 с.: ил. РГБ ОД, 61 11-2/172

Введение к работе

Актуальность проблемы. Терминация трансляции у эукариот и прокариот изучена значительно хуже, чем предшествующие стадии белкового синтеза - инициация и элонгация. В значительной степени это было связано с отсутствием адекватного метода определения активности факторов терминации транлсяции. Однако ситуация принципиально изменилась с разработкой новой тест-системы, которая позволяет анализировать отдельно каждую из 3-х основных стадий трансляции, получать претерминационный и терминационный комплексы и изучать роль каждого из компонентов системы отдельно и в любом сочетании.

Терминация трансляции у эукариот осуществляется факторами терминации eRFl и eRF3. eRFl распознает стоп-кодоны UAA, UAG и UGA и индуцирует гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Про функцию eRF3 известно, что этот белок содержит ГТФ/ГДФ-связывающий домен и взаимодействует с С-концевым доменом eRFl, а также является eRFl- и рибосомозависимой ГТФазой. eRFl человека состоит из трех доменов (N, М и С), что коррелирует с тремя различными функциями этого белка - распознавание стоп-кодона (N домен), индукция гидролиза пептидил-тРНК (М домен) и связывание с eRF3 (М и С домены). До сих пор не определены точно структурные элементы доменов eRFl, которые отвечают за выполнение той или иной функции белка, хотя некоторые предварительные гипотезы в литературе были высказаны. В течение последних десяти лет различные группы исследователей пытаются решить проблему декодирования стоп-сигналов в рибосоме, однако для эукариот это до сих пор не удалось. Опубликованные недавно кристаллические структуры бактериальных рибосом в комплексе с факторами терминации RF1/2 позволили идентифицировать аминокислотные остатки в бактериальных факторах терминации 1-ого класса, сближенные со стоп-кодонами, и, таким образом, выявить сайты их узнавания. Поскольку у эукариот всего один фактор терминации 1-ого класса, который узнает все три стоп-кодона, то, вероятно, механизмы распознавания стоп-кодонов в рибосоме у про- и эукариот различны. Так как до сих пор не получено кристаллической структуры эукариотической рибосомы, не говоря уже о терминационных комплексах, лучшим из возможных подходов для решения проблемы декодирования стоп-сигналов у эукариот является сайт-направленный мутагенез фактора eRFl с последующим тестированием функциональной активности полученных мутантов.

Цель и задачи исследования

Целью работы стала идентификация участков фактора терминации трансляции eRF 1 человека, ответственных за узнавание стоп-кодонов. Сформулированы следующие задачи исследования:

  1. Выявить аминокислотные остатки в N домене eRFl человека, ответственные за узнавание стоп-кодонов

  2. Выяснить роль С домена eRFl человека в узнавании стоп-кодонов

  3. Выяснить роль eRF3 человека в дискриминации стоп-кодонов

  4. Определить влияние 3'-контекста стоп-кодонов на эффективность терминации трансляции.

Научная новизна и практическая значимость работы

Узнавание стоп-кодонов фактором eRFl эукариот - один ключевых процессов, понимание механизма которого чрезвычайно важно для создания теоретической и экспериментальной базы данных РНК-белковых взаимодействий и изучения работы трансляционного аппарата клетки. В работе была использована полностью реконструированная in vitro система трансляции эукариот. Применение этой максимально приближенной к природной системы позволяет избежать ряда ограничений, накладываемых другими методами исследования.

Методом сайт-направленного мутагенеза получен широкий спектр точечных мутаций N-концевого домена eRF 1 человека. В ходе работы проанализировано около ста мутантных факторов более чем по 40 положениям в N домене eRFl человека и выявлены ключевые аминокислотные остатки, ответственные за узнавание каждого из нуклеотидов в стоп-кодонах. На основе этого предложена модель узнавания стоп-кодонов фактором терминации трансляции эукариот eRFl. Исследована также роль фактора eRF3 человека в узнавании стоп-кодонов. Показано, что eRF3 стимулирует работу eRFl и обладает корректирующей активностью в отношении его мутантных форм.

Кроме того на основании полученной нашими коллегами ЯМР-структуры С домена eRFl человека, в нем были выбраны позиции для сайт-направленного мутагенеза и подтверждена гипотеза о влиянии петли 357-367 eRFl человека на узнавание стоп-кодонов. Поскольку высказывалось предположение о том, что эта петля взаимодействует с 3'-контекстом стоп-кодонов, был получен набор мРНК, содержащих наиболее и наименее распространенные в геноме человека контексты стоп-кодонов. На этих мРНК были собраны претерминационные комплексы и показано влияние GC-состава 3'-контекста стоп-код она на эффективность терминации трансляции.

Результаты данной работы существенно углубляют понимание молекулярных механизмов терминации белкового синтеза у эукариот. Кроме того, изучение структурных и функциональных особенностей eRFl позволит в будущем разрабатывать новые методы коррекции наследственных дефектов и лечения различных заболеваний, связанных с преждевременной терминацией синтеза белка в клетке, которые вызваны появлением нонсенс-мутаций в кодирующей части мРНК. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: международной конференции «Ломоносов 2009», Москва, Россия, 13-18 апреля 2009 г.; международной конференции «Химическая биология -фундаментальные проблемы бионанотехнологии», Новосибирск, Россия 10-14 июня, 2009 г.; международной конференции «Protein Synthesis and Translational Control», Хайдельберг, Германия, 9-13 сентября 2010 г., международном форуме по нанотехнологиям, Москва, Россия, 6-8 октября 2010 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, материалы и методы, и выводы. Материал иллюстрирован 31 рисунком и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 158 цитированных работ.

Похожие диссертации на Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот