Введение к работе
Актуальность работы. Выявление пептидов и последующее изучение аминокислотного состава является важной задачей для контроля качества лекарственных препаратов и клинической диагностики социально-значимых заболеваний. В связи с этим возрастает необходимость разработки простых и недорогих чувствительных методов анализа пептидов, проявляющих биологическую активность. Также актуально на сегодняшний день развитие новых подходов в протеомном анализе для обнаружения низкокопийных пептидных биомаркеров. Это необходимо для определения особенностей индивидуального развития в области персонифицированной, спортивной медицины, геронтологии, а также для ранней диагностики заболеваний.
Перспективная задача клинической диагностики сегодня связана с идентификацией биомаркеров патологических состояний белковой природы, в качестве которых могут выступать низкокопийные пептиды. Большая часть имеющихся методов анализа не позволяют, к сожалению, в ходе одного эксперимента обнаружить присутствие низкокопийных пептидов. Поэтому для повышения предела чувствительности детекции маркерных пептидов необходимо использовать сочетание инструментальных микрометодов анализа (ВЭЖХ, MALDI TOF MS, электрофоретические и др.) и новых приемов аффинного обогащения пептидов (Sigdel and Sarwal 2011; Sigdel, Gao et al. 2012).
Прогресс в области разработки и внедрения медицинских микроаналитических методов диагностики в значительной мере обусловлен использованием ДНК и ее фрагментов. Предпосылкой для этого служит способность полинуклеотидов высоко специфически ассоциироваться с различными биополимерами и низкомолекулярными соединениями. Наиболее перспективный сегодня метод определения содержания в образцах сиквенс-специфичной ДНК (ПЦР, полимеразная цепная реакция) основан на использовании комплементарных взаимодействий олиго- и полинуклеотидов. Развитие методов ПЦР в реальном масштабе времени (Real Time ПЦР) позволяет сегодня не только идентифицировать целевую последовательность ДНК в клиническом образце, но и достоверно оценить ее количество (Ha, Lee et al. 2013; Sommeregger, Prewein et al. 2013).
Список сокращений: АК- аминокислоты, ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография, ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота, КЗЭ -капиллярный зональный электрофорез, МС-масс-спектрометрия, ПААГ- полиакриламидный гель, ПЦР- полимеразная цепная реакция, ACR-акридин, НЕХ- гексахлорфлуоресцеин, MALDI- ионизация лазерной десорбцией
Автор выражает благодарность проф., к.х.н. кафедры аналитической химии МИТХТ им. М.В. Ломоносова Глубокову Ю.М~| и зав.кафедрой биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова акад.РАМН, д.х.н., проф. Швецу В.И. за помощь и участие в работе.
В настоящее время остается актуальной разработка и оптимизация методов аминокислотного анализа как синтетических, так и природных биологически активных пептидов. Это связано с тем, что некоторые пептиды могут иметь модификации в аминокислотном составе. Поэтому при контроле качества лекарственных препаратов необходимо подтверждение их подлинности, что особенно важно в связи с перспективами использования бактерицидных пептидов (Mok and Li 2013). При классических условиях кислотного гидролиза происходит частичная потеря некоторых аминокислот, что не дает полной информации о составе исследуемого пептида. Для проведения анализа с помощью традиционных методов требуется сложное аппаратурное оформление и большой объем дорогостоящих токсичных реактивов для предколоночной или постколоночной дериватизации.
На основании всего выше изложенного становится очевидной необходимость разработки и оптимизации методов анализа для повышения чувствительности и надежности количественного определения низкокопийных пептидных биомаркеров и аминокислотного состава биологически активных пептидов в клинико-диагностических и фармакологических целях.
Представленная работа является частью научных исследований, проводимых в лаборатории искусственного антителогенеза Федерального государственного учреждения НИИ ФХМ ФМБА России в рамках проекта № 09-04-12133-офи_м «Нуклеопротеиновые конъюгаты для повышения эффективности протеомного анализа».
Цель работы заключается в разработке химических основ повышения чувствительности определения единичных молекул пептидных биомаркеров и оптимизации методов анализа аминокислотного состава биологически активных пептидов.
Задачи исследования.
1. Разработка принципиальной схемы анализа низкокопийных пептидов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала, включающей стадии:
аффинного связывания пептидов с модифицированными ДНК-аптамерами, снабженными реакционноспособной группой и маркерной нуклеотидной последовательностью;
получение нуклеопротеиновых конъюгатов;
исчерпывающее ферментативное расщепление исходного олигомера и частичное расщепление конъюгата;
анализ содержания целевого пептида в составе конъюгата с использованием приемов флуоресцентного анализа ПЦР в режиме реального времени.
2. Оптимизация известных методов анализа:
аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом капиллярного зонального электрофореза. Для увеличения выхода мономеров в работе необходимо рассмотреть влияние условий пробоподготовки образцов на процессы химической деградации аминокислот; провести его верификацию на примерах анализа образцов препаратов пептидов;
флуоресцентного ПЦР-анализа ДНК с регистрацией сигнала в реальном масштабе времени с использованием олигонуклеотидных зондов, содержащих лабильную гексахлорфлуоренильную метку (HEX). Разработка усовершенствованных методов получения зондов и испытание полученных препаратов в ДНК-анализе клинических образцов.
Научная новизна.
-
-
Разработана новая схема высокочувствительного анализа низкокопийных пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с помощью амплификации сигнала методом ПЦР в реальном масштабе времени.
-
Разработан новый способ деблокирования синтетических гексахлорфлуоресцеин олигонуклеотидов, препятствующий модификации метки и накоплению трудно отделяемого побочного продукта. Оптимизированы условия очистки олигонуклеотидных зондов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
-
Оптимизирована методика определения аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации с помощью капиллярного зонального электрофореза с прямым УФ-фотометрическим способом детектирования. Подобраны условия кислотного гидролиза пептидов, позволяющие увеличить выход образующихся аминокислот.
Практическая значимость
Разработан и предложен способ повышения чувствительности определения пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов методом ПЦР в режиме реального времени. Для создания системы ПЦР-амплификации ДНК-фрагмента конъюгата была отработана методика синтеза и режимов анализа для модификаций и очистки олигонуклеотидных зондов. Предложенные подходы для оптимизации способов получения зондов успешно использовались при создании и в производстве новых наборов для определения широкого круга патогенов (Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и др.). Проведение подобных исследований особенно актуально в связи с постоянной потребностью в расширении арсенала диагностических методов с жесткими критериями надежности. Оптимизированный метод аминокислотного анализа биологически активных пептидов позволяет определять состав без их модификации. Это существенно при контроле качества лекарственных белковых препаратов, как брадикинин, инсулин, дарбэпоэтин.
На защиту выносятся:
принципиальная схема обнаружения низкокопийных пептидов в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала;
разработка нового способа деблокирования меченных олигонуклеотидов, которая приводит к уменьшению образования примеси и увеличению чувствительности ПЦР- анализа;
оптимизированная методика определения аминокислотного состава биологически активных пептидов без предварительной стадии химической дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза.
Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на XIV Международной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам
«Ломоносов - 2007» (2007, Москва, Россия), 17-ой Менделеевской конференции молодых
ученых (2007, Самара, Россия), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в
химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, Москва, Россия), Life
Sciences 2007 (2007, Глазго, Великобритания), 22ndInternational Symposium on MicroScale
Bioseparations and Methods for Systems Biology, (2008, Берлин, Германия), 34th International
Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (2009,
Дрезден, Германия), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и
молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010» (2010, Москва,
Россия), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и
возможности» (2010, Москва, Россия), Всероссийской конференции «Аналитическая
хроматография и капиллярный электрофорез» (2010, Краснодар, Россия), 2-ой
Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева
«Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и
продуктов» (2010, Москва, Россия), V Всероссийской конференции студентов и аспирантов с международным участием «Химия в современном мире» (2011, Санкт- Петербург, Россия), 36th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2011 (2011, Будапешт, Венгрия), VI Всероссийской конференции студентов и аспирантов с международным участием «Менделеев-2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), FEBS 2012 (2012, Севилья, Испания).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в научных рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение методики и 15 тезисов докладов на международных и федеральных конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 132 источника отечественной и зарубежной литературы, иллюстрирована 53 рисунками, содержит 10 таблиц.
Похожие диссертации на Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов
-
