Введение к работе
Актуальность проблемы. Синтетические ДНК-дуплексы, содержащие модифицированные фрагменты, широко используются в настоящее время для решения различных задач молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Особый интерес среди них вызывают ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки. Эти соединения, обладая способностью к образованию ковалентных связей с рсакционноспособными группами биополимеров, являются чрезвычайно перспективными реагентами для изучения топографии активных центров белков и молекулярного механизма ДНК-белкового узнавания. В последние годы, в связи с развитием сенсовой биотехнологии резко возрос интерес к подобного рода соединениям. Особое внимание уделяется поиску новых реакционноспособных групп и разработке методов их направленного введения в структуру нуклеиновых кислот. Для получения таких соединений, как правило, используют достаточно сложный- и трудоемкий органохимический подход, включающий разработку специальных методов синтеза исходных модифицированных мономеров. В связи с этим остается актуальной проблема создания методов, позволяющих просто, надежно и с высокой эффективностью получать новые структуры ДНК, содержащие реакционноспособные группировки и обладающие наряду с устойчивостью к нуклеазной деградации, способностью к образованию прочных и специфичных ковалентно связанных комплексов с ДНК-узнаюшими белками, в том числе и с белками, участвующими в экспрессии генетического материала. Такие соединения могут необратимо ингибировать экспрессию вирусных генов, мутантных генов или онкогенов и, в перспективе, могут быть использованы в качестве терапевтических препаратов для лечения широкого спектра заболеваний, включая раковые заболевания и СПИД.
Цель настоящей работы - дизайн, синтез и исследование свойств новых типов ДНК-дуплексов, содержащих в сахарофосфатном остове реакционноспособные замещенные пирофосфатные межнуклеотидные группировки.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе исследованы закономерности введения реакционноспособных замещенных пирофосфатных группировок в сахарофосфатный остов линейных ДНК-дуплексов. Изучена зависимость эффективности реакции от структуры узла, в котором
образуется модифицированная связь, а также от природы ненуклеотидного заместителя в пирофосфатном остатке. Подобраны условия быстрого и количественного расщепления замешенной пирофосфатной группировки.
Разработан метод синтеза нового типа ковалентно связанных ДНК-дуплексов, содержащих реаюшонноспособную замещенную пирофосфатную группировку между комплементарными цепями. Изучены свойства образующихся соединений. Установлено, что замещённая пирофосфатная группировка в составе ковалентно связанных ДНК-дуплексов избирательно расщепляется под действием нуклеофильных агентов с переносом остатка одного из олигонуклеотидов, входящих в состав ковалентно связанного дуплекса, на нуклеофил. Впервые показано, что реакция нуклеофильного замещения идет одновременно по обеим фосфатным группам замещенной пирофосфатной группировки. Разработанные методы введения активных группировок между комплементарными цепями линейных ДНК-дуплексов, достаточно просты в экспериментальном отношении и могут быть использованы для введения реакционноспособных групп в ДНК-дуплексы любой длины и состава.
В настоящей работе предложен новый подход, позволяющий с высокой эффективностью получать ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы гантелеподобной структуры и вводить в их сахарофосфатный остов реакционноспособную замещённую пирофосфатную межнуклеотидную группировку. Он включает химическое лигирование в ДНК-дуплексах, образованных полинуклеотидом, концы которого сближены за счет введения гептануклеотидной последовательности, образующей
минишпилечную структуру з'...сада Изучена реакционная способность замещенной пирофосфатной группировки в составе полученных соединений. Показано, что ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы, содержащие замещённую пирофосфатную группировку, достаточно эффективно взаимодействуют с нуклеофилами в водной среде и в то же время обладают устойчивостью к действию клеточных экзонуклеаз. В связи с этим такие соединения, содержащие активную группу в участке узнавания ДНК-связываюших белков, являются перспективными реагентами для зондирования активных центров белков, а также могут использоваться в качестве их потенциальных ингибиторов.
Полученные в работе соединения, содержащие реакционноспособные замещенные пирофосфатные группировки, были использованы для изучения
механизма действия ферментов рестрикции/модификации R«coRIl, R-Ssoll, R-Mval, M-SsoU, а также фермента репарации урацил-ДНК гликозилазы. В результате были выявлены новые закономерности их функционирования.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4 статьи. Результаты работы докладывались на Международном семинаре по биологической модификации ДНК (Вильнус, 1994), 16-ом Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью Дели, Индия, 1994 г.), 3-ей Международной конференции по молекулярной биологии (Сингапур, 1995 г.), Международном конгрессе "Терапевтические олигонуклеотиды" (Рим, Италия, 1996 г.), Летней научной конференции FASEB (Вермонт, США, 1996 г.) и 12-ои Международном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое использование", (Лахойя, США, 1996 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 13 0 СТр машинописного текста, содержит 1 s рисунков, -3 таблиц. Диссертация состоит из введения, литературного обзора на тему "Реакционноспособные производные олигонуклеотидов: синтез и использование для ковалентного присоединения к биополимерам", обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.
