Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из проблем генной терапии является разработка стабильных, безопасных невирусных систем доставки терапевтических нуклеиновых кислот (НК) в клетки-мишени, которые по своей эффективности не уступали бы вирусным векторам. Использование катионных липосом в качестве таких систем является одним из перспективных подходов генной терапии. Положительно заряженные комплексы катионных липосом с НК (липоплексы) способны накапливаться на поверхности клеток и поглощаться ими по механизму эндоцитоза. Однако препятствием для широкого использования катионных липосом стало наличие внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые снижают эффективность доставки НК. Под внеклеточными барьерами подразумевают нестабильность липоплексов в биологических жидкостях и низкую специфичность взаимодействия с клетками-мишенями, под внутриклеточными - необходимость преодоления эндосомальной и ядерной мембран. Выявление биологических барьеров и установление их роли способствовали разработке новых систем доставки НК, которые эволюционировали от простых липидных молекул до высокоорганизованных модульных липидных транспортных систем (МЛТС).
Модульная липидная система доставки НК представляет собой самособирающийся транспортный контейнер, построенный из ковалентно несвязанных друг с другом липофильных модулей, и «запрограммированный» на преодоление биологических барьеров. МЛТС может содержать в своем составе следующие модули: 1) связывающий модуль -катионный амфифил/катионные липосомы - для электростатического взаимодействия с НК и ее защиты от действия нуклеаз; 2) адресный модуль - липоконъюгат с нацеливающим лигандом - для направленного транспорта в клетки-мишени; 3) стабилизирующий модуль -липофильное производное полиэтиленгликоля, снижающее взаимодействие с молекулами-дезактиваторами и увеличивающее время циркуляции систем доставки в организме; 4) модуль с последовательностью ядерной локализации для активного перемещения НК в ядро. Концепция МЛТС предполагает ее быстрое «переключение» на различные типы переносимых НК, различные типы клеток-мишеней и субклеточные компартменты. Поэтому все компоненты МЛТС должны быть легко заменяемыми, способными к саморазборке внутри клетки для эффективного высвобождения НК. Для быстрой замены липидные компоненты таких систем должны быть построены из унифицированных структурных блоков.
Одним из важнейших органов-мишеней, для которых разрабатываются МЛТС, является печень. Генетические нарушения клеток этого органа приводят к таким заболеваниям, как гемофилия, гиперхолестеринемия, рак печени. Известно, что гепатоциты экспрессируют асиалогликопротеиновые рецепторы, распознающие терминальные остатки D-галактозы или ТУ-ацетил-О-галактозамина, поэтому направленную доставку терапевтических НК в этот орган можно осуществить с помощью МЛТС, содержащей адресный модуль, представленный галактозосодержащим липоконьюгатом.
Данная работа посвящена синтезу адресных модулей - нейтральных неогликолипидов, получению адресных МЛТС, определению их физико-химических параметров и исследованию их нацеливающего потенциала.
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС им. Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках тематического плана «Фундаментальные исследования в области синтеза, изучения свойств природных биологически активных соединений и их аналогов с целью создания лекарственных субстанций для лечения социально значимых заболеваний человека», а также в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт П715) и грантов РФФИ 09-03-00874-а и 10-03-00995-а.
Цель работы заключалась в разработке препаративных подходов к синтезу нейтральных неогликолипидов линейной и разветвленной структуры, создании на их основе адресных модульных липидных систем доставки нуклеиновых кислот, а также изучении их физико-химических характеристик и исследовании специфичности связывания с углеводузнающим белком in vitro.
Научная новизна работы. Разработаны подходы и осуществлен синтез новых нейтральных неогалактолипидов, предназначенных для использования в качестве адресных модулей МЛТС. Для получения бивалентных неогалактолипидов использованы различные типы полифункциональных матриц, спейсерных и линкерных групп. Для оптимизации синтеза неогалактолипидов на основе L-глутаминовой кислоты предложен подход на основе модифицированной реакции Штаудингера. С целью выбора связывающего модуля адресных МЛТС исследована транспортная способность катионных липосом на основе моно- и поликатионного амфифилов и установлено, что амфифил на основе спермина обеспечивает наиболее эффективную доставку ДНК в клетки. Получены адресные МЛТС, содержащие синтезированные моно- или бивалентные неогалактолипиды, исследовано их связывание с углеводузнающим лектином RCAno и установлена зависимость эффективности данного процесса от строения гликолипидов и их количественного содержания в составе МЛТС. Выявлены эффективные адресные МЛТС, перспективные для дальнейших исследований in vitro и in vivo.
Практическая значимость работы. В ходе синтетических исследований, исходя из унифицированных структурных блоков, были разработаны препаративные подходы и получены 18 новых неогалактолипидов (адресный модуль МЛТС). Предложенные подходы и оптимизация отдельных синтетических стадий позволяют получать нейтральные неогалактолипиды в количествах, достаточных для создания новых адресных модульных систем доставки НК и проведения расширенных биологических испытаний in vitro и in vivo. Исследования по связыванию адресных МЛТС с углеводузнающим лектином RCAno выявили перспективные системы для дальнейшего изучения их способности доставлять НК в гепатоциты.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Синтез адресных модулей МЛТС, представленных нейтральными моно- и
бивалентными неогалактолипидами, с использованием матриц различного типа
(L-глутаминовой кислоты, 1,3-диаминопропан-2-ола и спермина);
-
Получение адресных МЛТС, содержащих синтезированые неогалактолипиды, и изучение их физико-химических параметров;
-
Исследование специфичности связывания адресных МЛТС с углеводузнающим лектином RCA]2o в зависимости от строения неогалактолипидов и их количественного содержания в системе доставки.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на III молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2009» (Москва, 2009 г.), XIII Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2010", (Суздаль, 2010 г.), II Международной конференции российского химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов» (Москва, 2010 г.), международной конференции "Liposomes in Jerusalem" (Израиль, Иерусалим, 2011 г.), VIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011г.), а также VI и VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 и 2013 г.г.).
Публикации. По результатам работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в отечественных и зарубежном журналах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (205 ссылок). Работа проиллюстрирована 3_3 рисунками и содержит К) схем и 7 таблиц.
