Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия предложен новый подход к терапии наследственных и приобретенных заболеваний, который основан на коррекции генетических нарушений с помощью терапевтических нуклеиновых кислот (НК). По химической природе НК являются полианионами и не способны самостоятельно проникать через биологические мембраны в пораженные клетки (клетки-мишени). Для решения этой проблемы создаются системы доставки НК, которые можно подразделить на биологические (вирусы) и искусственные (липосомы, полимеры). Вирусные системы переносят НК с высокой эффективностью, реализуя заложенные в их природе механизмы. Однако для них характерны иммуногенность, онкогенность, способность переносить НК ограниченного размера и высокая стоимость. Искусственные системы доставки НК лишены этих недостатков, но к настоящему времени не создано еще ни одной системы, сравнимой по эффективности с вирусными векторами.
Одним из важных требований, которые предъявляют к современным невирусным системам доставки, является способность направленно переносить НК в специфические клетки-мишени, что позволяет, с одной стороны, повысить эффективность таких систем, а с другой - уменьшить их неспецифическое поглощение здоровыми клетками, что должно положительно отразиться на безопасности систем доставки.
Известно, что на мембранах клеток определенных органов и тканей экспонированы специфические рецепторы, которые селективно распознают, связывают и поглощают молекулы (лиганды) определенного строения. Так, асиалогликопротеиновые рецепторы гепатоцитов связывают молекулы с терминальными остатками D-галактозы и ТУ-ацетил-Б-галактозамина, рецепторы дендритных клеток распознают остатки D-маннозы. Кроме того, различные патологические состояния могут характеризоваться повышенной экспрессией рецепторов определенного типа. Например, на мембранах опухолевых клеток при раке яичников, матки, толстой кишки, молочной железы, легких и почек, так же как и при опухолях, метастазирующих в головной мозг, наблюдается гиперэкспрессия фолатных рецепторов, которые селективно связывают и поглощают молекулы фолиевой кислоты. Таким образом, модификация поверхности липосомальных систем доставки НК лигандами, которые узнаются и связываются рецепторами клеток-мишеней, позволяет осуществить направленную доставку НК к месту ее терапевтического воздействия с помощью механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза.
Данная работа посвящена синтезу липоконъюгатов, содержащих в качестве адресных лигандов остатки фолиевой кислоты или углеводов, конструированию с их помощью
липосомальных систем доставки НК и исследованию их способности осуществлять направленный транспорт НК в клетки-мишени.
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС им. Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках тематического плана "Фундаментальные исследования в области синтеза, изучения свойств природных биологически активных соединений и их аналогов с целью создания лекарственных субстанций для лечения социально значимых заболеваний человека", а также в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (госконтракт П715) и грантов РФФИ 09-03-00874-а, 10-03-00995-а и 13-04-40183-н комфи.
Целью работы является разработка подходов к синтезу липоконъюгатов, содержащих в качестве лигандов к специфическим рецепторам клеток-мишеней фолиевую кислоту, D-галактозу или D-маннозу, включение их в состав адресных липосомальных систем доставки НК и исследование их биологических свойств.
Научная новизна работы. Разработаны подходы и осуществлен синтез новых фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов, предназначенных для модификации катионных липосом с целью придания им направленности к определенным рецепторам клеток-мишеней. Полученные липоконъюгаты, различающиеся типами лигандов, спейсерных и линкерных групп, использованы для создания адресных липосомальных систем доставки НК. Установлена зависимость трансфицирующей активности фолатсодержащих адресных липосом от структуры и количественного содержания в них адресных липоконъюгатов. Выявлены соотношения между количеством НК и адресных катионных липосом, необходимые для осуществления рецептор-опосредованного переноса НК. Показано, что липосомы, в состав которых входит 1.5% фолатсодержащего липоконъюгата с 20-звенным этиленгликольным спейсером, обеспечивают наиболее эффективную направленную доставку НК. С помощью маннозилсодержащих липосом осуществлена эффективная трансфекция незрелых дендритных клеток и их CD11с+ предшественников.
Практическая значимость. Предложены удобные подходы к получению фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов и получены 15 новых соединений в количествах, необходимых для проведения расширенных биологических испытаний. Разработана двухстадийная процедура, включающая твердофазную экстракцию и колоночную хроматографию на силикагеле, которая позволяет успешно выделять фолатсодержащие липоконъюгаты. На основе синтезированных липоконъюгатов созданы адресные липосомальные системы доставки НК к специфическим клеткам-мишеням, а исследование их трансфицирующей активности позволило выявить перспективные системы для дальнейшего осуществления направленной доставки НК в условиях in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Синтез новых липоконъюгатов, содержащих в качестве лиганда фолиевую кислоту, D-галактозу и D-маннозу.
-
Создание на основе синтезированных липоконъюгатов адресных катионных липосом и изучение их цитотоксичности и трансфицирующей активности.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на III, IV и V молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 2009, 2011, 2013), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2012» (Тула, 2012).
Публикации. По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих отечественных научных журналах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (140 ссылок). Работа проиллюстрирована 24 рисунками и содержит 5 схем и 6 таблиц.
Похожие диссертации на Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени
