Введение к работе
Актуальность проблемы
Функцией эпителиальных тканей организма, как пограничного образования, непосредственно контактирующего с кислородом воздуха, является обмен веществ между организмом и окружающей средой. Некоторые из этих тканей, в том числе обонятельный и респираторный эпителии, покрыты слизью, являющейся первым защитным барьером, обеспечивающим нормальное функционирование клеток эпителия и, следовательно, всего организма в целом. В условиях постоянного роста влияния на человека техногенных воздействий, изучение механизмов нарушения невосприимчивости организма к внешним условиям вызывает постоянный интерес.
Несмотря на значительные события, произошедшие за последние годы в развитии понимания механизмов, обеспечивающих барьерную функцию слизистых воздухоносных путей, клинического разнообразия условий, способствующих патологии процессов, и, как следствие, фармакотерапии, непрекращающийся рост социально-значимых бронхо-легочных заболеваний (астма, аллергия) приводит к выводу, что их причины многофакторны, далеко не все участники развития процесса идентифицированы и изучены, так как выделение природных белковых соединений в индивидуальном виде имеет свои специфические трудности. Поэтому большой фундаментальный и практический интерес представляет задача поиска и определения новых молекул белков-аутоантигенов, способствующих хронизации воспалительных процессов слизистых, специфических маркеров и белков, формирующих проницаемость защитного слоя тканей, контактирующих с внешней средой. Эти вещества потенциально могут служить сначала основой системы выявления факторов риска - критериями прогнозируемости рецидивирующего течения, а затем и лекарственных препаратов, корректирующих вышеупомянутые заболевания. Исходя из вышесказанного, структурно-функциональное изучение белков респираторного эпителия представляется значимым и интересным.
В лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ в слизи обонятельного эпителия крысы были идентифицированы новые секреторные белки: основной антиоксидант контактирующих с окружающей средой тканей пероксиредоксин VI (PrxVI, Peshenko, 1998) и Sec14p-подобный белок (rSec14p, Merkulova, 1999). Анализ аминокислотной последовательности rSec14p показал, что в его составе присутствует липид- связывающий домен SEC14. rSec14p широко представлен в слизистых оболочках эпителиальных тканей (его содержание в обонятельной выстилке составляет ~ 2 % от всех водорастворимых белков), формируя защитный слой контактирующих с внешней средой клеток, но его биохимическая и физиологическая роль была неизвестна. В 2009 году с использованием аллергических животных моделей (Shan L., 2009) была выявлена обратная зависимость между уровнем экспрессии гена rSec14p и степенью хронизации болезни. Недавнее исследование этих же авторов (Shan L., 2011) на трахее показало, что уменьшение экспрессии мРНК rSec14p в патофизиологических условиях, предусматривающих использование внешних воздействий, вызвано только гибелью клеток реснитчатого эпителия, в которых белок синтезируется, а не изменением уровня экспрессии его гена. Это обстоятельство сдерживает прогресс в понимании механизмов естественной невосприимчивости организма и требует дальнейших исследований rSec14p в условиях других патофизиологических моделей.
Открытием, с которым в последние годы связывается надежда на выявление новых перспективных терапевтических мишеней развития воспалений, явилось обнаружение в организмах млекопитающих представителей семейства гликогидролаз 18 - хитиназ и хитиназоподобных белков (chitinase-like proteins, CLPs). Показано, что накопление того или иного члена семейства гликогидролаз 18 является отрицательным прогностическим маркером многих заболеваний самой различной этиологии.
В данной работе описаны исследования структуры и функций двух новых секреторных белков обонятельного эпителия, вовлеченных в иммунный ответ организма, - липидсвязывающего rSec14p и защитного хитиназоподобного белка rYmlolf.
Цель и задачи исследования
Данная работа является частью исследований, проводимых в ИБХ РАН по поиску и изучению белков, участвующих в обеспечении нормального функционирования эпителиальных тканей. Цель диссертационной работы состояла в определении функциональной роли белка rSec14p, поиске и идентификации его возможных биологических партнеров, а также структурно-функциональной характеризации новых белков, синтезирующихся на разных стадиях развития воспалительных реакций в слизистых оболочках. Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:
-
Выделить природный rSec14p в гомогенном состоянии, оценить уровень его экспрессии в патологически измененных объектах;
-
Идентифицировать новый обнаруженный белок обонятельного эпителия (в последствии назван нами rYm1olf), определить его полную аминокислотную последовательность, клонировать его структурный ген;
-
Разработать животную модель воспалительного заболевания в отсутствие внешних раздражителей и исследовать функциональную роль белков rSec14p и rYmlolf на разных стадиях развития защитной реакции организма.
Научная новизна и практическая значимость работы
В процессе исследования белок rSec14p был получен в гомогенном состоянии, создана модель экспериментальных животных, на которой впервые было продемонстрировано резкое увеличение его количества в условиях острого воспаления по сравнению с контролем. При этом обнаружен новый ранее неизвестный белок с молекулярной массой 43 кДа.
С помощью масс-спектрометрии проведена идентификация нового белка и установлена его частичная аминокислотная последовательность. Выяснено, что он относится к семейству гликогидролаз 18, резкое увеличение синтеза и секреции представителей которого в условиях формирования иммунной защиты, ассоциировано со слизистыми оболочками. В соответствии с местом локализации (epithelium olfacctorium) и подобием с мышиным белком Ym1, новый белок назван нами rYm1olf.
Определена и проанализирована полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего rYm1olf обонятельного эпителия крысы, включая участки его 5 - и 3-нетранслируемых областей. Определена структура его мРНК. Последовательность полноразмерной кДНК rYmlolf депонирована в международную базу данных GenBank (под номером JF781276).
Установлена последовательность предшественника зрелой формы rYmlolf крысы. Полноразмерный зрелый белок rYmlolf содержит 380 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 42986 Да. При этом подтверждены ранее полученные данные о том, что хитин не является обязательным антигеном для индукции синтеза хитиназоподобных белков.
Разработаны и созданы крысиные модели с синдромами острого системного и хронического воспалений. С помощью ПЦР-анализа в реальном времени показано резкое синхронное увеличение уровней экспрессии rYmlolf и rSec14p в обонятельной выстилке модельных животных с острым воспалением на первые сутки, что говорит о совместном вовлечении этих белков в иммунный ответ организма. Все представленные в данной работе результаты получены впервые и приоритетны. Сделанные выводы весьма перспективны для возможного выявления изучаемого нами белка rSec14p как показателя развития воспалительных заболеваний воздухоносных путей.
Поскольку накапливание белков подсемейства CLPs в тканях является отрицательным прогностическим маркером многих воспалительных заболеваний самой различной этиологии, rYmlolf может стать потенциальной терапевтической мишенью при заболеваниях дыхательных путей.
Апробация работы
По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в рецензируемых научных журналах. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях: Международной конференции FEBS «Новые концепции липидологии: от липидомики до болезней» (SM06-07) (Нидерланды, Нарвайкерхуд, 2006); IV и V Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Казань, 2009, Петрозаводск, 2011); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва, 2009); Х чтениях памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2011); ХХ Международной конференции и дискуссионном научном клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2012).
Структура диссертации
Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов и экспериментальной части, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Материал иллюстрирован рисунками и таблицами.
