Введение к работе
Актуальность проблемы. Ионы Са2+ и процессы фосфорилировапия/ дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных впеїшіих и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фулдаментальпыми биологическими функциями, как клеточная пролиферация и дифферепцировка, иммунитет, транспорт. Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с G-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - транедупин -цГМФ-фосфодиэстераза послужили прототипами для огромпого числа работ по системам рецептор - G-белок - эффекторпый белок, функционирующим в клетках других типов.
Многие эффекты Са2+ на системы клеточной сигнализации опосредованы Са +- связывающими белками, мишенями для которых очень часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Са^-связываюшгш белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилировапия/ дефосфорилировапия посвящено огромное число работ; фоторецепторная клетка в этом отношении - исключение. К настоящему времени ясны общая картина и многие детали зрительной транедукции у позвопочпых животных, в частности, доказана важность фосфорилпровапия родопсина для аттенюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторенепторной клетки. Однако систематическое и интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрапсдуклии у позвоночных животных, в том числе - в регуляции фосфорилировання
зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей нротеинкпназы
(родопсинкиназы), бьио начато лишь недавно, во многом благодаря
обнаружению в 1991 году Са2+-связывающего белка рековерина.
Актуальность настоящей работы обусловлена тем, что она в значительной степени заполняет пробел в понимании механизмов Са2+-зависимой регуляции фототрапсдукнии; кроме того, полученные данные важны для выяснения молекулярных оспов патологических состояний фоторецепторной клетки.
Цель работы. Цель настоящей работы - идентификация клеточпой мишени (или мишеней) рековерина и установление его функции в фоторецепторной клетке.
Научная новизна. К моменту начала настоящей работы имелись лишь предварительные указания на способность ионов Са2+ модулировать фосфорилирование родопсина в фоторецепторной клетке; функция обнаруженного 1991 г. нового фоторецепторного Са2+-связывагощего белка рековерина к этому моменту не была установлена. В настоящей работе продемонстрирована и детально исследована Са2+-зависимая регуляция фосфорилирования родопсина в наружных сегментах, палочки (НСП) сетчатки быка и доказано, что ипгибирующий эффект ионов Са2+ на фосфорилирование родопсина опосредован рековерином. Установлено, что клеточными мишенями для рековерина могут служить родопсинкиназа, катализирующая фосфорилирование родопсина, и протеинфосфатаза 2А, отвечающая за дефосфорнлирование фосфоопсина; эти данные, полученные in vitro, говорят о том, что рековерин in vivo может вьшолнять функцию "кальциевого сенсора" для указанных ферментов. Показано, что эффективность рековерипа как Са2+-зависимого ингибитора значительно
выше в реакции фосфорилирования "темпового", чем фотоактивированного родопсина; высказана оригинальная гипотеза, предполагающая, что одна из функций рековерина в фоторецепторпой клетке - предотвращение нежелательной реакции фосфорилирования "темнового" родопсина и тем самым создание благоприятных условий для выполнения родопсинкиназой ее основной функции - фосфорилировапие фотовозбужденного родопсина. Получены рекомбннаптный немиристоилированнып и миристоилированный рековерин и показано, что N-копцевое миристоилирование рековерина увеличивает его ингибирующую эффективность в реакции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой.
Практическая ценность. Установление клеточных мишеней и функции рековерина в фоторецепторпой клетке нобходимы для понимания механизмов зрительной трансдукдпи и выяснения молекулярных основ зрепия. Полученпые результаты важпы и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка служит удобной моделью для понимания устройства других сигнальных систем с участием сопряженных с G-белками рецепторов, нарушение функционирования которых служит причиной разнообразных патологических состояний клетки.
Апробация работы состоялась на семинаре отдела энзпмологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 20 сентября 1996 г. и на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ 25 сентября 1996 г.
Материалы работы докладывались па конференции ФЕБО по биологическим мембранам (Хельсинки, 1994 г.), па 1-ом Российско-Турецком симпозиуме по биотехнологаи (Анкара, 1995 г.) и Международной конференции, посвященной 90-летию А.Н. Белозерского (Москва, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на
