Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск белков с новыми фармакологическими свойствами, которые могут использоваться в качестве инструментов для фундаментальных исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также служить основой для создания новых лекарственных препаратов, является актуальной проблемой современной биоорганической химии. Яды змей, представляющие собой сложные многокомпонентные белковые смеси с ярко выраженной биологической активностью, до сих пор остаются ценными источниками таких соединений. Яды змей исследуются уже давно и к настоящему моменту большинство из них достаточно хорошо изучено. Наиболее вероятно, что соединения с новыми свойствами могут быть обнаружены либо среди мало представленных в ядах соединений, либо в малоизученных или вовсе не изученных ядах. В свете этого представлялось весьма актуальным проведение исследования компонентов яда гадюки Никольского {Vipera nikolskii), обитающей в лесостепной зоне на юге России и Украины. Эта змея лишь недавно была выделена в новый вид, а ранее рассматривалась как черная (меланистическая) форма гадюки обыкновенной Vipera berus. Яд V nikolskii совершенно не исследован и может содержать новые белки, не встречающиеся у V berus.
Следует также отметить, что в последнее время с применением методов генной инженерии идентифицировано большое количество белков, представляющих собой новые типы и подтипы рецепторов и ионных каналов. Однако их функциональная характеристика зачастую затруднена отсутствием специфических лигандов. Яды змей служили и продолжают служить источником селективных лигандов рецепторов и ионных каналов. В качестве примера можно привести а-нейротоксины, сыгравшие важную роль в изучении никотиновых холинорецепторов. Тем не менее, возможности змеиных ядов как источников для выделения токсинов со специфической структурой и функцией использованы лишь в небольшой степени.
Данная работа посвящена изучению яда гадюки Никольского с целью структурной характеристики новых белков, которые могут быть использованы для решения обозначенных проблем.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлись идентификация, выделение и структурно-функциональные исследования ранее неизвестных белковых токсинов, принадлежащих к разным
структурным семействам. В качестве объекта исследования была выбрана гадюка V. nikolskii.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
Выбрать семейства белков змеиных ядов, новые представители которых могут быть найдены у гадюк V. nikolskii и V. berus.
Осуществить оптимизацию условий клонирования для идентификации экспрессирующихся новых белков.
Провести клонирование и секвенирование кДНК, кодирующих новые белки ядов V. nikolskii и V. berus, и установить полные аминокислотные последовательности идентифицированных новых компонентов.
Выделить из ядов новые белки, для которых установлены аминокислотные последовательности, и исследовать их биологическую активность.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено исследование яда нового вида гадюки - гадюки Никольского. В результате идентифицирован ряд новых белков, для которых установлены аминокислотные последовательности. Эти белки принадлежат к различным структурно-функциональным семействам, включая фосфолипазы Аг, протеолитические ферменты и их ингибиторы, трехпетельные токсины и др. Так, в яде V. nikolskii обнаружены две гетеродимерные фосфолипазы А2, установлены их полные аминокислотные последовательности и изучена биологическая активность. Отсутствие этих ферментов в яде гадюки обыкновенной V. berus подтверждает корректность выделения V. nikolskii в отдельный вид. Определены также аминокислотные последовательности никобина, новой тромбиноподобной сериновой протеиназы, и ингибитора протеиназ типа Кунитц. Некоторые тромбиноподобные протеиназы используются в диагностике состояния системы гомеостаза, в частности, в так называемом рептилазном тесте. Поскольку никобин отличается по последовательности от известных протеиназ, он может обладать уникальными свойствами. Впервые в яде змей подсемейства Viperinae идентифицированы белки семейства CRISP (цистеин-богатые секреторные белки), для которых установлены аминокислотные последовательности. Также впервые в подсемействе Viperinae показана экспрессия трехпетельных токсинов в ядовитой железе V. nikolskii. Эти токсины являются основными компонентами ядов змей семейства Elapidae. У всех изученных белков обнаружены уникальные замены в функционально-важных участках молекул, что может приводить к изменению специфичности воздействие на их биологические мишени. Таким образом, в практическом плане эти белки
могут оказаться перспективными для создания новых инструментов исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также в качестве основы для создания новых фармацевтических препаратов.
Апробация работы. Результаты работы представлялись на следующих симпозиумах и конференциях: VIII Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная памяти академика Ю.А. Овчинникова, (Москва, 2006), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), IV Российский симпозиум "Белки и пептиды", (Казань, 2009), 13-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2009), второй международный симпозиум "Биофарма-2010 от науки к промышленности" (Ереван, 2010), V Российский симпозиум "Белки и пептиды", (Петрозаводск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка
литературы, включающего цитируемых работ. Работа изложена на
страницах, содержит таблиц и рисунков.
