Введение к работе
Актуальность проблемы.
В процессе регуляции внутриклеточных функций и передаче трансмембранного сигнала важное место занимают GTP-связывающие белки. Эта обширная группа включает многие десятки белков, имеющих сходство как в структуре, так и в механизме действия. Хорошо исследованы так называемые G-белки - гетеротримерные gtp-эзы, опосредующие передачу сигнала с рецептора на эффек-торный белок.
Другой обширной группой GTp-связывающих белков в клетке являются ras-подобные белки. В семейство ras-подобных белков входят GTP-азы с молекулярной массой 20-30 кДа, обладающие различной степенью гомологии между собой и а-субъединицами G-белков . Подобно G-белкам некоторые из них служат субстратами для дор-рибозилтрансфераз. В отличие от G-белков ras-подобные белки - мономеры, обладают значительно меньшей GTP-азной активностью и требуют дополнительного белка для ее усиления. Ras-подобные белки принимают участие в регулировке многих клеточных процессов, таких как дифференцировка, организация цитоскелета, передача трансмембранного сигнала, везикулярный транспорт и секреция. Различные ras-подобные белки обнаружены во многих эукарио-ческих организмах и практически во всех тканях млекопитающих Точный механизм их действия еще только начинает проясняться, не известны и белки эффекторы. Однако уже ясно, что в процессе функционального цикла эти белки могут находится в GDP-связанном "неактивном" и gtp-связэнном "активном" состоянии. Показано , что цикличность этих gtp-эз между GTP-связанным и gdp-связэнным состояниями регулируется тремя классами белков: активаторами gtp-эзы (gaps), ингибиторами диссоциации gdp (gdis) и активаторами
обмена gtp/gdp (gdss) . Последние два типа регуляторних белков способны также модулировать взаимодействие низкомолекулярных GTP-аз с мембраной.
Для исследования G-белков и низкомолекулярных gtp-эз сегодня широко применяют различные бактериальные токсины, действующие на эукариотичсскую клетку через ADP-рибозилирование регуляторних белков. Линии сип
Clostridium botulinura ПРОДУЦИРУЮТ ADP-рибОЗИЛТраНСферазу ,
названную экзоэнзкмом СЗ . Этот фермент в присутствии nad+ adp-рибозилирует по остатку Asn-4i некоторые ras-подобные белки,
ОТНОСЯШЄСЯ К СемеЙСТВу rho, Е ЧЭСТНОСТИ rho A, rho В, rho С,
гасі и гас2 . Субстраты СЗ были обнаружены во всех исследованных клетках эукариот. В ряде работ указывается на важную роль белков этого семейства в процессах клеточной дифференцировки и построении цитоскелета .
Цель работы.
Данная работа является частью комплексного исследования белков зрительной системы, проводимого в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Работа посвящена поиску и характеристике низкомолекулярных gtp-связывэ-ющих белков- субстратов экзоэнзима СЗ в фоторецепторных клетках кальмара юидо pacificus и в НСП сетчатки быка.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В фоторецепторных мембранах быка и кальмара обнаружены низкомолекулярные gtp-связывающие белки с молекулярными массами 20-30 кДа.
Исследован состав и клеточная локализация субстратов ботули-нической ADP-рибозилтрансферазы С3 (С3) в фоторецепторных клет-
ках кальмара и НСП сетчатки быка. Показано, что в мембранах кальмара ADP-рибозилируются полипептиды с молекулярными массами 22, 24, 30, 45 и 80 кДа, а в мембранах НСП - 22, 24 и 60 кДа. Цитоплазматическая фракция НСП содержит субстраты С3 с м.м. 22, 24, 28 и 36 кДа.
Произведено частичная хроматографическая очистка субстратов 22 и 24 кДа из фоторецепторных мембран быка и кальмара и показано влияние гуаниловых нуклеотидов и ионов мд2+ на процесс их ADP-рибозилирования.
Разработана схема хроматографической очистки субстрата С3 36 кДа, при помощи которой этот белок был выделен в гомогенном состоянии.
Показано влияние света на процесс ADP-рибозилирования субстратов С3 22 и 24 кДа быка и кальмара. Обнаружено взаимодействие этих белков с фотоактивировэншм родопсином кальмара, что предполагает их участие в передаче зрительного сигнала.
Выделение и характеристика субстратов экзоэнзима С3 фоторецепторных клеток позволяют продолжить исследования по определе-шга их первичной структуры и выяснению роли этих белков в зрительном процессе.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 2 статьи, материалы диссертации докладывались на 5 Международном симпозиуме по ретиналь-со-держащим белкам ( Париж ), на I и 2 конференциях по направлению "Белковая инженерия" ( Москва ).
Объем работы.
Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, посвященного ras-no-добным белкам, результатов и обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.
