Введение к работе
Актуальность проблемы. Метод аффинной модификации белков активированными нуклеиновыми кислотами (НК) достаточно широко применяется в биохимии и молекулярной биологии, но в качестве объектов в основном используются белки с низкой степенью специфичности по отношению к НК - гистоны, рибосомные белки и т.д. Важным классом белков, специфически взаимодействующих с ДНК, являются широко используемые в молекулярной биологии ферменты рестрикции-модификации П-го типа. Эти ферменты узнают короткие нуклеотидные последовательности и расщепляют или модифицируют их по обеим цепям. Применение метода аффинной модификации белков аналогами ДНК открывает широкие возможности для анализа структуры и функционирования этих ферментов. Однако, подходы к созданию реагентов для ковалентного присоединения к ферментам рестрикции-модификации П-го типа малочисленны и не разработаны до конца.
Объектом наших исследований явились ферменты рестрикции-модификации EcoRII, Mval, Ssoll и эндонуклеаза рестрикции ВяШ, которые узнают последовательность или CCNGG (5joII; N - А или Т, G или С). Ферменты модификации EcoRll (M-coRII) и Mval (M-Mval) метилируют последовательность С*СТ/дСЮ (или C*CNGG -M-SjoII) по 5-ому положению (M-iscoRH, M-Ssoll) или по N-4 положению (M-A/val) внутреннего остатка цитозина (показано звездочкой). Эндонуклеазы рестрикции coRII (R-EcoRll), Угаї (R-A/val), Ssoll (R-Ssoll) и BstNl (R-BstNl) гидролизуют участки узнавания как показано стрелками:
5' 4CCUT/AGG У 5' 4CCNGG 3'
4- - R-EcoRll, U - R-Bstm. R-Mval і - R-Ssoll
Эти ферменты нуждаются в кофакторах для функционирования - З-аденозил-Ь-метионине (SAM) для ферментов модификации и нонах Mg2+ для эндонуклеаз рестрикции.
На кафедре химии природных соединений благодаря использованию синтетических субстратов установлены группы атомов в ДНК, взаимодействующие с этими ферментами, исследован кинетический механизм реакции, получены негидролизуемые аналоги субстратов. Однако ничего не известно о том, какие домены белковой молекулы взаимодействуют с субстратом и о конформационном состоянии белка в комплексе с субстратом. Одним из подходов к решению этой проблемы является ковалентное присоединение белков к модифицированному олигонуклеотиду с последующим протеолизом белкового компонента и анализом полученного пептида. Зависимость степени аффинной
модификации белков реагентами от внешних условий может дать информацию о механизм ферментативного катализа.
Целью настоящей работы является разработка методов ковалентного присоедннени ферментов рестрикции-модификации к активированным субстратам, оптимизация услови аффинной модификации белков, исследование механизма функционирования ферментов пр помощи данного метода н определение оптимальной схемы выделени олигонуклеотидопептндов - продуктов тршггического гидролиза конъюгатов ферментов олигонуклеотидом.
К реагентам для ковалентного присоединения к ферментам рестрикщш-модификаци] предъявлялись следующие требования: наличие активных групп, специфичность действие .(наличие участка узнавания ферментов, минимальное искажение структуры, "точечные модификации в участке узнавания).
Научная новизна и практическая ценность работы. Сконструированы реагенты, содержании участок узнавания ферментов, ітя аффинной модификации ферментов рестрикции модификации П-го типа. ДНК-дуплексы, содержащие остаток br-MU, были направлены н; зондирование центров в белке, контактирующих с гетероциклическими основаниями учасгкг узнавания. ДНК-дуплексы с монозамещенной пирофосфатной связью вместо расщепляемо? эндонуклеазами рестрикции фосфодиэфирной связи использовались для исследования каталитических центров ферментов. ДНК-дуплексы с монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связью, не совпадающей с местом разрезания эндонуклеазами рестрикции позволяли изучать аминокислотные остатки, взаимодействующие с углеводофосфатнъш остовом субстратов. Обнаружено, что дуплекс с монозамещенной пирофосфатной связью в центре участка узнавания образует комплексы с эндонуклеазами рестрикции coRII, ifval, Ssoll и Bsttil н расщепляется ими, причем coRII расщепляет такой дуплекс по двум фосфодиэфирным связям: канонической и соседней с ней с З'-конца. Показано образование конъюгзтов ферментов рестрикции-модификации с дуплексами, содержащими монозамещенную пирофосфатную межнуклеотидную связь и ферментов рестрикции A/Val, BstHl и Ssoll с субстратом, содержащим остаток br^dU. На основе анализа зависимости степени аффинной модификации эндонуклеаз рестрикции дуплексом с монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связью от концентрации нонов Mg2+ предполагается следующее: 1) гонформационные перестройки в комплексе R-A/val с субстратом при последовательном включении двух нонов Mg'+; конформапионная перестройка комплекса R-EcoRII с субстратом, сопровождающаяся изменением аминокислотного окружения ДНК,
при увеличении концентрации кофактора. Показано, что эндонуклеаза рестрикции Ssoll взаимодействует с ДНК-дуплексом, содержащим или не содержащим участок узнавания, почти с одинаковой эффективностью в отсутствие ионов Mz , т.е. специфическое узнавание субстрата происходит в присутствии кофактора на стадии катализа. Предложена и отработана схема выделения олигонуклеотидопептидов, которые образуются после трипсинолюа продукта ковалентного присоединения эндонуклеазы рестрикции Ssoll к ДНК-дуплексу, содержащему монозамешенную пирофосфатную связь.
Полученные результаты важны как для понимания механизма функционирования ферментов рестрикции-модификации П-го типа, так и для дальнейшего использования метода аффинной модификации белков аналогами субстратов для исследования высокоспецифического белково-нуклеинового узнавания.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на IV-ом симпозиуме New England Biolabs "Эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы: Структуры и механизмы" (Вермонт, США, 1993). на конференции New England Biolabs по биологической модификации ДНК (Вильнюс, Ліггва, 1994), I Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Белковая инженерия" Государственной научно-технической программы России "Новейшие методы биоинженерии" (Москва, 1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структуоа и объем работы. Диссертация изложена на' «Ь страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (15В ссылок), содержит 26 рисунков и 12-таблиц.
