Введение к работе
Актуальность проблемы.
Современные исследования в молекулярной генетике и генной инженерии трудно представить без широкого применения рестрик-цконных эндонуклеаз различной специфичности. Несмотря на уже имеющийся большой набор ферментов рестрикции, -поиск новых не теряет актуальности. Менее исследованными являются комплементарные ферменты бактериальной системы рестрикции-модификации (RM) - модифицирующие ДНК метилазы. В последнее время эти ферменты стали привлекать все большее внимание исследователей. Отчасти это связано с необходимостью более полной характеристики рестрик-ционных эндонуклеаз в отношении их чувствительности к метилированным субстратам. С другой стороны, метилазы являются привлекательными как новые объекты для изучения взаимодействия белков и нуклеиновых кислот. Очень интересными являются ферменты с "необычными'' специфичностями. Исследование таких ферментов' открывает новые возможности не только для экспериментальной молекулярной генетики и генной инженерии, но и способствует более глубокому пониманию феномена рестрикции-модификащш в частности и эволюционных аспектов развития микроорганизмов в целом.
Цель работы. Настоящая работа посвящена исследованию новых ферментов рестрикция-модификации, обнаруйеных и выделенных в Институте биотехнологии "Fermentas". В задачу работы входило разработка удобного метода определения специфичности метилвз при помощи синтетических субстратов, включающего определение природы модифицируемого основания и локализацию его в узнаваемом участке.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе определена специфичность 4-ех новых рестриктаз, которые стали коммерческими препаратами "Fermentas" и 5-ти новых бактериальных ДЖ-метилаз.
В системе RM 11-го типа впервые обнаружена и охарактеризована рестрикционная эндонуклеаза Есо57 I, обладающая бифункциональными свойствам, т.е. способная расщеплять и модифицировать ДНК.
Впервые обнаружены и исследованы ДНК-метилазы Alw26 І, ЕсоЗі I, ЕзрЗ I, способные модифицировать два различных основашя (А и С) в комплементарных последовательностях узнаваемого участка.
В работе предложены удобные методы определения продуктов биометилирования, включающие природу модифицируемого основания и локализацию его в узнаваемом участке, при помощи синтетических олигонуклеотидных дуплексов.
Результаты настоящей работы способствовали расширению ассортимента ферментов для работы с ДНК. Охарактеризованные рестрикционные эндонуклеазы в настоящее время являются коммерческими препаратами "Fermentas".
Апробация работы. Результаты работы докладывались в' мевдународных конференциях: Second New England Blolabs workshop on biological DNA modification, Berlin, 1990; Seventh international oymposlum on raethabollBtn and enzymology or nucleic acids Including gene and protein engineering, Bratislava, 1990; в Всесоюзном симпозиуме "Ферменты рестрикции-модификации ДНК: от генов до белков Вильнюс, 1989.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и обьем работы. Диссертация изложена на 130 страница машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатав, экспериментальной части, выводов, списка литературы, содеркит 18 рисунков и 15 таблиц.
