Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Системы рестрикции-модификации у прокариот 9
1. 1. 1. Сайт-специфические эндонуклеазы и ДНК-метилтрансферазы 9
1. 1.2. Классификация ферментов систем рестрикции-модификации 9
1. 1.3. Системы рестрикции-модификации типа І Ю
1. 1.4. Системы рестрикции-модификации типа II 1О
1. 1.5. Системы рестрикции-модификации типа III 12
1. 1.6. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации 13
1. 1.7. Распространение систем рестрикции-модификации 14
1. 2. Метилирование ДНК в E.coli и ее роль в регуляции генной экспрессии 16
1.3. Регуляция экспрессии генов в системах рестрикции-модификации 18
1.3. 1. Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации Llal из Lactococcus lactus 19
1.3.2. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа I и III 20
1.3.3. Регуляция экспрессии генов в системах рестрикции-модификации типа II 21 1. 4. Общая характеристика структурных и функциональных свойств ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. Coli 30
1. 5. Особенности нуклеотидной последовательности промотора и инициация транскрипции 31
1. 6. Транскрипционная интерференция 36
1.6. 1. Механизмы транскрипционной интерференции Зо
1.6. 1. 1. Конкуренция промоторов Зо
1.6. 1.2. Механизм "сидячей утки" Зо
1. 6. 1. 3. Окклюзия 4"
1.6. 1.4. Столкновение 1
Глава 2. Материалы и методы исследований 43
2. 1. Материалы 43
2. 1. 1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора 43
2. 1.2. Среды и основные буферы 43
2. 1.3. Материалы и реактивы 44
2. 2. Методы исследования 45
2. 2. 1. Получение бактериальной биомассы 45
2. 2. 2. Выделение плазмидной ДНК 45
2. 2. 2. 1. Лизис щелочью 45
2. 2. 2. 2. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия 46
2. 2. 3. Выделение тотальной РНК 47
2. 2. 4. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация 47
2. 2. 5. Анализ рекомбинантных клонов 48
2. 2. 6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 48
2. 2. 7. Препаративное выделение фрагментов ДНК 49
2. 2. 8. Плазмидные конструкции 49
2.2. 9. Мечение 5'-концаДНК полинуклеотидкиназой фагаТ4 50
2. 2. 10. Реакция транскрипции in vitro 50
2. 2. 11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 51
2. 2. 12. Лигирование фрагментов ДНК 51
2. 2. 13. Реакция метилирования in vitro 51
2. 2. 14. Образование комплекса M.Ecll8kl с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Eel 18kl 52
2. 2. 15. Защита ДНК от расщепления ДНКазой I 52
54
2. 2. 16. КМп04 (перманганатный) футпринтинг 53
2.2. 17. Реакция удлинения праймера 2. 2. 18. Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы
рестрикции-модификации Ес118кТ
2. 2. 19. Экспрессия и очистка метилтрансферазы M.Ecll8kI-N6His
до гомогенного состояния 55
2. 2. 20. Очистка РНК-полимеразы 56
2.2.21. Электрофорез ДНК и белков 56
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Структурная организация системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl 57
3. 2. Определение сайта связывания M.Ecl 18kl 60
3. 3. Генетическая организация регуляторной области системы рестрикции-модификации Eel 18kl 61
3. 4. Регуляция транскрипции с промоторов генов ec!18kI.R и ecll8kI.M,
осуществляемая метилтрансферазой M.Ecl 18kl in vitro 63
3. 5. Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы
рестрикции-модификации Eel 18kl 71
3. 6. Модель регуляции транскрипции генов системы рестрикции-модификации Ecll 8kl 74
Выводы 76
Список литературы
- Системы рестрикции-модификации типа І
- Получение бактериальной биомассы
- Мечение 5'-концаДНК полинуклеотидкиназой фагаТ4
- Генетическая организация регуляторной области системы рестрикции-модификации Eel 18kl
Введение к работе
Проблема регуляции активности генов является одной из главных проблем
молекулярной биологии. Выяснение механизмов регуляции генной активности необходимо для понимания того, как функционирует клетка или отдельно взятая генетическая система. Системы рестрикции-модификации (СРМ) типа II состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК; эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (МТ). Эндонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в сайте узнавания, таким образом, она способна фрагментировать немодифицированную специфическим путем ДНК. Энзиматическое метилирование цитозиновых или адениновых оснований ДНК-метилтрансферазой в сайте узнавания защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой.
Большинство генов СРМ локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерия-хозяин, но не имеющих плазмиды содержащей СРМ, так и в бактерии других видов. Очевидно, что в момент попадания плазмиды, несущей гены СРМ, в "наивную" клетку, не имеющую такой системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. В противном случае, возможна гибель клетки-хозяина за счет преждевременной экспрессии ЭР или недостаточной продукции МТ, а вместе с хозяином погибнет и плазмида, содержащая СРМ. Способность таких плазмид к горизонтальному переносу между разными видами бактерий накладывают еще одно требование - регуляция экспрессии генов СРМ должна быть не зависима от хозяйских регуляторних факторов, которые могут существенно различаться у разных бактерий. Несмотря на существование различных способов организации генов СРМ типа II (Рис. 1), отражающее различные молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов СРМ, для успешного заселения бактериальной клетки должны быть соблюдены следующие условия: 1) белок МТ должен быть синтезирован первым и уровень его активности должен
быть достаточным, чтобы обеспечить быстрое метилирование (защиту) всех сайтов узнавания в геномной ДНК хозяина;
активность белка ЭР должна появиться не раньше, чем будут прометилированы все сайты в ДНК хозяина;
на более поздних стадиях уровень метилазной активности может быть понижен, чтобы не допустить упреждающего метилирования чужеродной ДНК. Но даже такой пониженный уровень метилазной активности должен быть достаточным для того, чтобы обеспечить полное метилирование всех геномных сайтов узнавания (последнее требование предполагает, что наличие даже одного неметилированного сайта узнавания приведет к гибели клетки за счет действия ЭР).
Таким образом, слишком низкое соотношение МТ/ЭР активностей приведет к клеточной гибели в результате ав і орестрикции, слишком высокое соотношение МТ/ЭР активностей не обеспечит клетке защиту при проникновении чужеродной ДНК. Поэтому для выживания клетки-хозяина необходим строгий кон і роль экспрессии генов СРМ.
Однако, несмотря на очевидное существование регуляции экспрессии генов СРМ, на сегодняшний день крайне мало известно о регуляторных механизмах. Это определяет актуальность всестороннего изучения процесса регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации.
Цель данной работы - определить молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl. Исходя из этого, перед нами были поставлены следующие задачи:
локализовать промоторы генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl;
выявить характер влияния метилтрансферазы M.Ecll8kI на активность промоторов генов СРМ Eel 18kl.
Системы рестрикции-модификации типа І
Ферменты CPM типа I проявляют эндонуклсазную и метилазную активность одним и тем же мультиферментным комплексом, состоящим из трех субъединиц R, М и S. Молекулярная масса всего комплекса может достигать 700 кДа. Различные его субъединицы отвечают за метилазную и рестриктазную активности. Ферментам этого класса, в качестве кофакторов, требуются ионы Mg2+, ATP и SAM. Они обладают АТР-азной активностью, причем локализация разрывов ДНК строго не детерминирована, обычно это 100-1000 н.п. от последовательности узнавания. S - субъединица определяет специфичность, как для расщепления, так и для модификации ДНК. Причем гены, кодирующие М и S субъединицы, транскрибируются как отдельный оперон, а ген, кодирующий R субъединицу, транскрибируется отдельно со своего промотора. 1.1. 4. Системы рестрикции-модификации типа ЇІ
ЭР и МТ, входящие в состав СРМ типа II представлены отдельными белками, в основном небольшой молекулярной массы. Единственным кофактором, в котором нуждаются эндонуклеазы этого ісласса, являются ионы Mg +, для действия МТ обычно они не нужны. МТ этого класса переносят метальную группу от SAM на определенные основания в последовательности узнавания, с образованием К6-метилдезоксиаденина (т А-МТ), или Ж-метилдезоксицитозина (т4С-МТ), или 5-метилдезоксицитозина (m С-МТ). Последовательности узнавания нуклеотидов по существу симметричны и включают в себя от 4 до 8 н.п., но могут включать и в виде неопределенных прерываний дополнительный нуклеотид. Точки расщепления фосфодиэфирных связей в нуклеотидной последовательности ДНК строго детерминированы в пределах или в непосредственной близости от сайта узнавания. ЭР, как полагают, действуют главным образом как гомодимеры, а метилазы - как мономеры. По характер) расщепления ДНК, ЭР II класса подразделяют на несколько субклассов: IIP, 1IW, IIN, IIS, IIT, IIU и HE (Kessler and Manta, 1990; Yang and Topal, 1992). Бактериальные МТ катализируют перенос меі ильной группы с SAM на С5 позицию цитозинового основания (С5-цитозиновые МТ) или на экзоциклическую аминогруппу цитозинового или адешшового основания (N4mC и N6mA МТ) внутри специфической последовательности ДНК. В отличие от ЭР, для которых не найдено существенной гомологии в их аминокислотных последовательностях, для МТ обнаружены общие консервативные домены. 5-метилцитозиновые ДНК-метилтрансферазы характеризуются одинаковым строением белковой молекулы, по длине которой расположено 10 консервативных блоков аминокислот. Структура амино-МТ значительно отличается от структуры т5С МТ. Белковая молекула амино-МТ содержит только 9 консервативных блоков, которые соо і ветствуют I-VIII и X аминокислотным мотивам т5С МТ. Более того, порядок расположения консервативных блоков в аминокислотных последовательностях амино-МТ, в отличие т5С МТ, не характеризуется строгой линейной направленностью. Поэтом} , исходя из порядка расположения аминокислотных блоков, класс амино-МТ разделяют па три основные группы (а, Р, у) (Malone et al., 1995).
Аминокислоты, входящие в консервативные блоки как для ш5С, так и для амино-МТ, участвуют в осуществление общих стадий реакции метилирования ДНК, взаимодействуют с донором метальной группы - SAM, существенны для правильной укладки полипептидной цепи и функционирования ферментов. У m5C МТ между VIII и IX консервативными блоками расположена TRD последовательное і ь (target recognition domen), которая является частью вариабельного района и отвечает за узнавание специфической последовательности-мишени ДНК, подлежащей метилированию. 1.1. 5. Системы рестрикции-модификации типа III
У ферментов СРМ типа III, так же как и у ферментов СРМ типа I, и метилазная и рестриктазная активности проявляются одним ферментным комплексом, но состоящим из двух различных субъединиц. В отличие от ферментов СРМ типа I, эти ферменты не обладают АТР-азной акшвностыо, хоч я АТР является их кофактором. SAM не является обязательным кофактором для эндопуклеаз III класса, а лишь стимулирует расщепление субстратной ДНК. В присутствии ионов Mg2+ эндонуклеаза расщепляет ДНК на расстоянии 25 - 27 н.п. от последовательности узнавания и это расстояние может немного варьировать. Причем, для ферментов этого типа нельзя добиться полного гидролиза ДНК, ни увеличением количества фермеп га, пи увеличением времени инкубации.
Ферменты СРМ типа III занимают промежуточное положение между ферментами СРМ типов I и II. Они представляют собой двухсубъединнчные белки, которые обладают как метилазной, так и эндонуклеазнои активностями. Субъединица М (mod) обладает узнающей и метилазной активностями, а субъединица R (res), обладая эндонуклеазнои активностью, может функционировать только в комплексе с субъедиппцей М. Ферменты СРМ типа III узнают коропсие пепалипдромные последовательноеш, метилированию подвергается только одна из цепей ДИК в сайте узнавания. Для реакции метилирования ферментам СРМ типа 111 необходим SAM, который также стимулирует расщепление субстратной ДНК (Bist et al., 2001).
Получение бактериальной биомассы
Этот метод использовали для масштабного выделения плазмидной ДНК (Sambrook et al, 1989). Осадок, полученный из 500 мл культуры, ресуспендировали в 10 мл раствора I и свежеприготовленного раствора лизоцима в конечной концентрации 5 мг/мл. Суспензию инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли 20 мл раствора П. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Для быстрой ренатурации денатурированной щелочью ДНК добавляли 15 мл раствора III и инкубировали 10 мин при 4С. Хромосомная ДНК и обломки клеток образовывали на дне пробирки плотный осадок после центрифугирования при 12 000 об./мин на роторе J-14 центрифуги "J2-21" фирмы "Beckman" (США) в течение 30 мин при 4С.
К супернатанту добавляли 0,6 объема изопропанола. Хорошо перемешивали и оставляли на 15 мин при комнатной температуре. Суспензию центрифугировали при 6 000 об./мин на роторе J-14 ("Beckman", США) 30 мин при комнатной температуре. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 1 - 2 мл ТЕ буфера. 2. 2. 2. 2. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия
К миллилитру раствора ДНК добавляли 1 г сухого CsCb. Растворяли соль и добавляли раствор бромистого этидия 10мг/мл до конечной концентрации 600 мкг/мл. Конечную плотность раствора проверяли рефрактометрически (r\ = 1,386). Центрифугирование проводили при 45 000 об./мин в течение 24 часов на вертикальном роторе Vti-65 центрифуги "L5-65" фирмы "Beckman" (США).
Зону плазмидной ДНК отбирали с помощью иглы № 21 для подкожных инъекций, проколов ею с боку стенку пробирки. Бромистый этидий удаляли следующим образом: а) к раствору ДНК приливали равный объём изопропанола, насыщенного NaCl; б) смешивали обе фазы; в) центрифугировали при 6 000 об./мин на центрифуге "К-23" (Германия) 5 мин при комнатной температуре; г) удаляли верхнюю изопропанольную фазу, содержащую бромистый этидий; д) процедуру повторяли 3-4 раза, и ДНК из раствора осаждали тремя объемами 96% этанола; е) осадок растворяли в небольшом количестве ТЕ-буфера (100-200 мкл). 2. 2.3. Выделение тотальной РНК
Тотальную РНК выделяли из ночной культуры клеток Е. coli К802, содержащих соответствующие плазмиды. Очистку РНК проводили с использованием SV Total RNA Isolation System (Promega) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Полученные препараты РНК обрабатывали свободной от РНК ДНКазой I и снова очищали в соответствии с протоколом Promega. Для оценки качества полученную тотальная РНК анализировали в 1% агарозном геле с добавлением формамида. 2. 2. 4. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация
Для введения ДНК в клетки использовали метод трансформации с применением хлористого кальция (Sambrook et al., 1989). Из единичной колонии реципиентного штамма с одно-, двух- дневной чашки в 5 мл LB получали ночную культуру. Одним мл этой культуры инфицировали 100 мл бульона LB. Клетки выращивали при 37С в стандартной качалочной колбе до плотности 5 10 клеток/мл, что соответствует оптической плотности при 550 нм ОД=0,2. Выросшую культуру переносили в стеклянные пробирки и охлаждали во льду в течение 10 мин. Суспензию клеток центрифугировали 10 мин при 2500-3000 об./мин на центрифуге "К-23" (Германия) при 4С. Удаляли супернатант и клетки мягко без образования пузырьков ресуспендировали в 50 мл 0,1М СаСЬ. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 1-2 часа, а затем повторно осаждали клетки центрифугированием в тех же условиях. Удаляли супернатант и мягко ресуспендировали клетки в 5 мл 0,1М СаСЬ, 15% глицерина. Компетентные клетки расфасовывали на аликвоты объемом 0,2 мл в предварительно охлаждённые мини-пробирки и хранили при -70С. Полученные данным способом компетентные клетки обеспечивали воспроизводимый в течение, по крайней мере, двух-трех месяцев хранения уровень трансформации, который составлял 5 105-5 106 бактериальных клонов на 1 мкг ДНК.
Далее к 200 мкл размороженным непосредственно перед этим компетентным клеткам добавляли 2-4 мкл раствора ДНК (не более 50 нг на пробу). Смесь инкубировали 1 час при 0С. Затем проводили тепловой шок при 42С - 2 мин и охлаждали во льду 3-5 мин. К смеси приливали по 0,2 мл бульона LB и инкубировали при 37С в течение одного часа. Необходимое количество клеток (20-50 мкл) растирали стерильным шпателем на подсушенных чашках Петри с богатой агаризованной (1,5%-ный агар) средой, содержащей селективный антибиотик. 2.2.5. Анализ рекомбинантных клонов
Анализ рекомбинантных плазмид проводили методом ПЦР с использованием соответствующих праймеров. При отборе рекомбинантных клонов при помощи "бело-голубого" теста, основанного на а-комплементации р-галактозидазной активности, на 20 мл агарозованной среды, добавляли 20 мкл 0,1 М ИПТГ и 40 мкл 2% X-gal. 2.2. 6.
Мечение 5'-концаДНК полинуклеотидкиназой фагаТ4
Замороженные клетки Е. coli M15[pREP4, pQE30(ec/18kIM-N6His)], полученные из 300 мл бактериальной культуры после 5 ч. роста при индукции ИПТГ, оттаивали при комнатной температуре, суспендировали в 8 мл буфера А (20 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8,0), 500 мМ NaCl,10 мМ имидазола) и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе "MSE" (Англия) (20 сек - импульс, 2-3 мин - охлаждение) при 4С. Полноту разрушения клеток контролировали по снижению мутности суспензии при 590 нм. Клеточные обломки осаждали центрифугированием в течение 1 ч при 20 000 об./мин (в роторе JA-20 центрифуги J2-21 "Beckman" (США)) при 4С. Полученный супернатант наносили со скоростью 4 мл/ч на колонку с сорбентом Ni-NTA фирмы "Qiagen" (США), предварительно уравновешенную буфером А. Объем сорбента 1 мл. После промывания колонки 10 объемами буфера А, связавшиеся белки элюировали линейным градиентом концентрации имидазола (20-100 мМ) того же буфера со скоростью 4 мл/ч. Содержимое всех элюированных фракций тестировали на наличие метилтрансферазной активности, используя ДНК фага лямбда. Количественно оценивалось содержание белка в каждой фракции методом электрофореза в ПААГ. Две белковые фракции, элюировшие в градиенте имидазола межу 40-60 мМ, содержали наибольшее количество белка метилтрансферазы M.Ecll8kI-N6His и обладали повышенной ферментативной активностью. Содержимое этих фракций объединяли и диализовали против 10 объемов буфера для диализа белков и хранили при -20С. Концентрация белка в препарате в расчете на мономер составляла 5 мкМ (M.Ecll8kI). Кор- и а холофермент РНК-полимеразы Е. coli были очищены как описано Минахиным с соавт. (Minakhin et al., 2003). Очистка проведена Захаровой М.В.
Электрофорез ДНК в агарозном геле проводили в гелях разной концентрации (0,7-2.0 %) в горизонтальном блоке на приборе фирмы "Bio-Rad" (США) на пластинах (1,5-3,0 х 135,0 х 110,0 мм) в тех же буферах при различном напряжении (20-150 В) в зависимости от поставленной задачи. В лунки вносили по 10-40 мкл образца с сигнальным красителем - бромфеноловым синим. По окончании электрофореза гели окрашивали 10-20 мин в водном растворе бромида этидия (1-2 мкг/мл), отмывали и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Электрофорез белков проводили в 12% ПААГ на приборе фирмы "Helicon" (Россия), в вертикальном блоке, толщина геля 0,75 мм в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970). В качестве стандартов использовали белки из набора фирмы "Pharmacia" (Швеция) с молекулярными массами: 94 кДа - фосфорилаза Б, 67 кДа - БСА, 43 кДа -овальбумин, 30 кДа - карбоникангидраза, 20 кДа - ингибитор трипсина, 14,4 - а-лактальбумин. Гели окрашивали 0,2%-ным кумасси бриллиантовым голубым R-250 фирмы "Bio-Rad" (США).
Структурная организация системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl Система рестрикции-модификации типа II Ecll8kl была обнаружена в штамме Enter ohacter cloacae и располагалась на природной плазмиде pECL18 (Den mukhametov et al., 1997). Фрагмент ДНК, содержащий СРМ Ecll8kl, был клонирован в мультикопийную векторную плазмиду pUC129 - и плазмида была названа рВсп. Система состоит из двух генов, расположенных дивергентно относительно друг друга, на расстоянии 109 п.н. (Рис. 5). Гену ecll8kI.R соответствует ОРС размером 915 н.п., кодирующая белок размером 305 а.о. (35937 Да), гену ес118к1.Мсоответствует ОРС размером 1137 н.п., кодирующая белок размером 379 а.о. (42887 Да). Сравнение нуклеотидной последовательности генов СРМ EcllSkI с СРМ SsoII показало, что они отличаются по восьми нуклеотидам. Следует отметить, что в межгенных областях обеих систем замен не было обнаружено.
Ранее было показано, что M.SsoII, связываясь с операторной областью расположенной в межгенной области, снижает экспрессию собственного гена и одновременно повышает экспрессию гена ЭР ssoII.R in vivo (Karyagina et al., 1997). Для изучения молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов СРМ Ecll8kl был проведен ряд экспериментов.
Генетическая организация регуляторной области системы рестрикции-модификации Eel 18kl
В этих условиях не наблюдается защиты от действия ДНКазы І в области соответствующей промотору гена ecll8kI.R (Рис. 10, дорожка 3); однако слабые сигналы КМ1Ю4 — чувствительных тиминов свидетельствуют об образовании открытого комплекса с промотором гена ecll8kI.R (Рис. 10, дорожка 7). M.Ecll8kI специфически защищает от расщепления ДНКазой I область ДНК в положении от -14 и до +39 относительно стартовой точки транскрипции гена есП8Ы.М(в положении от +15 и до +67 относительно стартовой точки транскрипции гена ecll8klR) (Рис. 10, дорожка 2). При добавлении в реакционную смесь M.Ecll8kI, вне зависимости от порядка добавления РНК-полимеразы, образование открытого комплекса с промотором гена ecll8kI.M сильно ослабевает (Рис. 10, дорожки 8 и 9). При этом сильно стимулируется образование открытого комплекса с промотором гена ecllSklR, а также появляется область, защищаемая от расщепления ДНКазой І в положении от -47 и до +12 от стартовой точки транскрипции гена ec!18kI.R (Рис. 10, дорожки 8 и 9). Учитывая месторасположение оператора M.Ecll8kI (от положения +7 до +20 относительно стартовой точки транскрипции гена ecll8kI.M) и области ДНК защищаемой связанной M.Ecll8kI (от -14 до +39), ингибирование транскрипции с промотора гена ecll8kI.M метилтрансферазой M.Ecll8kI должно быть простым следствием стерической помехи. И если механизм ингибирования транскрипции с промотора гена ес118Ы.М был понятен, не ясен оставался механизм активации промотора гена ecllSklR, поскольку оператор M.Ecll8kI расположен в положении от +33 до +47 относительно точки начала транскрипции гена ecllSklR, а метилтрансфераза M.Ecll8kI, образуя комплекс с ДНК, защищает её в положении от +15 до +67. В принципе, промотор гена ecll8klR может быть активизирован метилтрансферазой M.Ecll8kI непосредственно (например, посредством белок-белкового взаимодействие между метилтрансферазой M.Ecll8kI, связанной с оператором, и РНК-полимеразой, или косвенно, то есть, как простое следствие помехи создаваемой метилтрансферазой
М.Ес118кІ, связанной с оператором, для образования открытого комплекса молекулой РНК-полимеразы с промотором гена ecll8kI.M). Чтобы лучше понять эффект влияния метилтрансферазы M.Ecll8kI связанной с оператором на активность промотора гена ecll8kI.R, были выполнены эксперименты по транскрипции in vitro, а также ДНКаза I и КМп04-футпринт на фрагменте ДНК, содержащей промотор гена ecll8kI.R и сайт связывания M.Ecll8kI, но не содержащей промотор гена ecll8kI.M.
Из данных полученных в эксперименте по транскрипции in vitro (Рис. 11), следует, что промотор гена ecll8kI.R транскрибируется с одинаковой эффективностью, как в присутствие, так и в отсутствие M.Ecll8kI. Из чего следует, что этот промотор конститутивный и для нормальной работы не нуждается в активации какими-либо дополнительными факторами.
Эксперименты по защите ДНК от ДНКазы I и КМпСч-футпринтинга на фрагменте ДНК, также не содержащей промотор гена ес118Ы.М показали, что взаимодействие с РНК-полимеразой приводит к появлению на ДНК, в области промотора гена ecll8kI.R, участка защищенного от расщепления ДНКазой I (Рис. 12, дорожка 3), и появлению тиминов чувствительных к воздействию КМпСч соответствующих промотору гена ecll8klR (Рис. 12, дорожка 7). В тоже время, добавление M.Ecll8kI в реакционную смесь приводит к образованию комплекса M.Ecll8kI с оператором (Рис. 12, дорожки 4 и 5), но не приводит к каким либо заметным изменениям места связывания РНК-полимеразы (Рис. 12, дорожки 4 и 5), и изменению активности промотора гена ecll8kI.R (Рис. 12, дорожки 8 и 9). Из этого следует, что наличие M.Ecll8kI не обязательно для работы промотора гена ecll8kI.R
]pecll8kLR ДНКазаІ КМп04 РНКП MTEcll8kI РНКП Ecll8kl.M 1 2345678 9 в отсутствие промотора гена ес118Ы.М. +++++А-- Рис. 12. Метилтрансфераза M.EcllSkl не влияет на локализацию участков взаимодействия и образование открытых комплексов с РНК полимеразой E.coli в области промотора гена ecll8kLR в отсутствии промотора гена ес118к1.М. Меченный у-Р фрагмент ДНК, содержащий промотор гена ecll8kI.R, сайт связывания M.Ecll8kI, но не содержащий промотор гена ecll8kI.M (1), инкубировался с белком M.Ecll8kI (2), РНК-полимеразой E.coli (3), а также в комплексе M.Ecll8kI + РНК-полимераза (4 и 5) с разной последовательностью добавления в присутствии неспецифической ДНК и обрабатывали ДНКазой I. КМпС 4-реакции выполняли в тех же условиях: с добавлением РНК полимеразы E.coli (7), а также комплексов M.Ecll8kI + РНК-полимераза (8 и 9) с разной последовательностью добавления, (6)-A+G реакция. Электрофорез проводили в 7% денатурирующем ПААГ и визуализировали с помощью радиоавтографии.
Отсутствие прямого влияния M.Ecll8kI на транскрипцию с промотора гена ecll8kI.R также было подтверждено in vivo. В экспериментах по удлинению праймера с использованием конструкции, в которой был делетирован промотор гена ес118Ы.М, но оставался неизменным промотор гена ecll8kI.R и сайт связывания M.Ecll8kI, было показано, что наличие или отсутствие в клетке M.Ecll8kl практически не оказывает влияния на активность промотора гена eclJ8kI.R (Рис. 13). Более того, заметно даже небольшое ослабление сигнала, что связано, по-видимому, с тем, что M.Ecl 18kl, образуя комплекс со своим сайтом связывания, немного мешает нормальной транскрипции с промотора гена ecll8kI.R. Рис. 13. Реакция удлинения праймера с использованием конструкции, в которой был делегирован промотор гена ес118кІ.М в присутствии и отсутствии метилтрансферазы M.cI18kI. В реакции использовали тотальную РНК выделенную из клеток Е. coli с плазмидой, содержащей конструкцию в которой был делегирован промотор гена есї18кІ.М. Метилтрансфераза M.Ecl 18kl вносилась в клетки на совместимой плазмиде. В качестве праймера использовали олигонуклеотид, комплементарный последовательности репортерного galK-гена. Промотор гена ecl!8kI.R (pecll8kI.R) проявляет активность как в отсутствии (-Ecll8kI.M), так и в присутствии метилтрансферазы M.Ecl 18kl (+Ecll8kI.M). Продукты реакции разделяли в 7% денатурирующем ПААГ и визуализировали с помощью радиоавтографии.
При выполнении экспериментов КМпО/гфутпринтинга, нами были получены данные, указывающие на то, что при увеличении количества РНК-полимеразы в реакции происходит образование двух открытых комплексов: комплекс с промотором гена ecll8kI.M и второй комплекс, не уступающий по интенсивности, с промотором гена ecll8kI.R (Рис. 14, дорожка 5). Следут отметить, что интенсивность сигнала образования открытого комплекса с промотором гена ecll8kI.R полученного с использованием избытка РНК-полимеразы аналогична интенсивности сигнала образования открытого комплекса полученного в результате добавления в реакцию M.Ecl 18kl (Рис. 14, дорожка 6), M.Ecl 18kl в этой ситуации ослабляла образование открытого комплекса с промотором гена ес118Ы.М, но не приводила к
