Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Метилирование и другие эпигенетические факторы, влияющие на
экспрессию генов 11
1.1.1 Гистоны и метилирование ДНК 12
1.1.2 Петли хроматина и метилирование ДНК 13
1.1.3 Метилирование при импринтинге 14
1.1.4 Регуляторные белки CTCF и KAISO 16
1.1.5 Тканеспецифичность транскрипции генов обусловленная метилированием. 17
1.2 Изменения уровня метилирования при различных патологиях 19
1.2.1 Гипометилирование ДНК 20
1.2.1.1 Активация онкогенов 21
1.2.1.2 Метилирование мобильных элементов 22
1.2.1.3 Хромосомная нестабильность 24
1.2.3 Метилирование ДНК и горячие точки мутаций 26
1.3 Особенности транскрипции генов с промоторов не содержащих канонических TATA-последовательностей 28
1.3.1 Основные свойства инициаторного элемента (inr) 31
1.3.2 DPE элемент промотора (downstream promotor element) 33
1.3.3 Проксимальный (pse) и дистальный (dse) промоторые элементы 35
1.3.4 МТБ элемент (motif ten element) 36
1.3.5 DCE элемент (downstream core element) 36
1.3.6 Элементы, специфические для he содержащих тата-последовательность промоторов 37
1.3.7 cpg островки 38
1.3.8 частные случаи регуляции генов не содержащих тата-последовательность.39
1.3.8.1 Регуляция транскрипции генов NKR-P1 семейства 39
1.3.8.1.1 Структура промотора гена Ly49 и тканеспецифичность экспрессии 40
1.3.8.1.2 Особенности гена KLRB1 42
1.3.8.2 Регуляция транскрипции гена PROM1 43
ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение 48
2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов klrb1 и prom1 48
2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях 48
2.1.2 Транскрипция в эмбриональном легком человека 49
2.1.3 Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода 50
2.1.4 Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5'-областях генов PROM1 и KLRB1 54
2.1.4.1 5'-RACE гена KLRB1 55
2.1.4.2 Транскрипция изоформ гена PROM1, отличающихся по содержанию экзона 4 58
2.1.4.3 Тканеспецифичность экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов Р1 иР2 58
2.2 Определение статуса метилирования участков генов prom1 и KLRB1 59
2.2.1 Использование деметилирующего агента 5-Аза 59
2.2.2 Бисульфитное секвенирование промоторов Р1 и Р2 гена PROM1 61
2.2.2.1 Метилирование промотора Р1 63
2.2.2.2 Метилирование промотора Р2 65
2.4.2.1 Характер метилирования промоторов Р1 и Р2 66
2.2.3 Анализ метилирования промотора Р2 метил-специфическим ПЦР 67
2.2.4 Метилирование и транскрипция 68
2.2.5 Определение метилирования в протяженных участках генов KLRB1 и PROM1. 71
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 73
3.1 Материалы 73
3.1.1 Ферменты и реактивы 73
3.1.2 Оборудование 73
3.1.3 Расходные материалы 74
3.1.4 Буферные и другие растворы 74
3.1.5 Микробиологические среды 74
3.1.6 Клеточные линии 75
3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов 75
3.2 Методы исследования 77
3.2.1 выделение рнк и геномной днк 77
3.2.1.1 Выделение РНК 77
3.2.1.2 Определение концентрации РНК 77
3.2.1.3 Анализ вьщеленной РНК методом гель электрофореза 77
3.2.1.4 Выделение геномной ДНК 78
3.2.1.5 Высаживание 78
3.2.2 Обработка днказой 78
3.2.3 Синтез первой цепи КДНК 78
3.2.3.1 Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР 78
3.2.3.2 Контроль на наличие примесей ДНК, "-ОТ" контроль 79
3.2.3.3 Построение первых цепей кДНК для 5'-RACE 79
3.2.4 ПЦР 79
3.2.4.1 ОТ-ПЦР 79
3.2.4.2 Геномная ПЦР 80
3.2.4.3 Электрофорез 80
3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и ПЦР фрагментов 80
3.2.6 нуклЕотидные последовательности и их анализ 80
3.2.7 Бисульфитное секвенирование 81
3.2.7.1 Секвенирование CG-богатых областей генов PROM1 и KLRB1 81
3.2.7.2 Секвенирование промоторного участка гена PROM1 81
3.2.8 Молекулярное клонирование 82
3.2.8.1 Лигирование 82
3.2.8.2 Клонирование 83
3.2.8.3 Трансформация 83
3.2.8.4 Выращивание ночной культуры клеток 83
Выводы: 84
Список литературы: 85
- Петли хроматина и метилирование ДНК
- Транскрипция в клеточных линиях
- Буферные и другие растворы
- Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР
Введение к работе
Онкологические заболевания являются второй по частоте причиной смертности в развитых странах. При неоплазиях нарушаются механизмы контроля процессов дифференцировки и пролиферации клеток, связанные с нарушением генетического аппарата клеток. Одним из принципиальных моментов в борьбе с опухолью является ранняя диагностика. Для повышения эффективности диагностирования рака на ранних стадиях и выбора путей лечения необходимо выявление общих для большинства опухолей данного типа генов, изменение экспрессии которых сопровождает появление и развитие опухоли. Такие гены называют маркерными. Не всегда эти маркерные гены играют существенную роль в процессах образования и развития опухоли, и ни один из множества исследованных молекулярных маркеров в отдельности не обладает значительной клинической ценностью при анализе гетерогенных опухолей. Однако использование группы характерных генов-маркеров может значительно повысить надежность ранней диагностики заболевания.
С другой стороны, изучение основ регуляции генов, и, в особенности, маркерных, может иметь важное значение для терапии опухоли.
Одной из характеристик определяющих функциональный статус гена является метилирование. Метилирование ДНК вносит свой вклад в механизмы контроля экспрессии генов и играет важнейшую роль в клеточной физиологии. Всё больше данных говорит в пользу того, что определённый характер метилирования генома важен для нормального функционирования клеток и целых органов. Определенный характер метилирования ДНК устанавливается во время эмбрионального развития организма, и его изменения могут привести в дальнейшем к нарушениям развития, преждевременному старению, прогрессии опухолевых заболеваний, подавлению экспрессии онкосупрессоров (гены, подавляющие развитие опухолей). На данный момент накоплено много данных об аберрантном метилировании в различных опухолях, о его корреляции с уровнем экспрессии, стадией развития и происхождением опухоли. Подобное влияние метилирования вероятно проистекает из того, что при его помощи происходит регуляция транскрипции генов. Считается, что метилирование регуляторных элементов генов, таких как промотор, энхансер и инсулятор обычно приводит к супрессии функции гена. Метилирование района интрона - наоборот, может обеспечить активность гена, поскольку в этом случае, метилирование интрона может препятствовать взаимодействию с белками-репрессорами. Неактивное состояние гена так же может быть обусловлено особой компактной структурой хроматина (гетерохроматина), которая образуется в результате взаимодействия ДНК со специфическими хромосомными белками. В некоторых случаях
образование такой структуры хроматина объясняют метилированием ДНК и, напротив, деметилирование ДНК может сопровождаться активацией гена.
Обычно уровень метилирования генов сохраняется в процессе развития организма. Однако в зависимости от множества факторов, он может меняться при его взрослении. Подобные изменения могут являться, как нормальным ответом клетки на действующие на нее внешние стимулы, так и происходить в результате неправильной работы каких-либо клеточных систем.
Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ дифференциальной транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. Механизмы, вовлеченные в регуляцию экспрессии генов, вполне могут быть вовлечены в процессы опухолевой прогрессии, и на современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия на структуры, способствующие развитию опухоли. По этой причине, экспрессируемые на поверхности клеток рецепторные белки, которые могут узнаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами и/или моноклональными антителами, являются перспективным объектом для диагностики и для специфически направленной иммунотерапии и иммуномодуляции опухолевых заболеваний.
Рецептор CD161, кодируемый геном KLRB1, экспрессируется NK и NKT-клетками. Оба типа клеток обладают цитотоксической активностью и способны узнавать и уничтожать различные виды клеток, в том числе опухолевые, вирус-инфицированные клетки и чужеродные трансплантанты. Биологическая функция рецептора CD 161 человека до сих пор остается неясной, предполагается, что он может участвовать как в регуляции цитотоксических функций клеток, так и в регуляции продукции цитокинов. Механизмы регуляции экспрессии KLRB1 гена до сих пор не изучены.
Основным конечным продуктом гена PROM1 является трансмембранный гликопротеин CD 133. Он является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и, с недавнего времени, используется при скрининге ГСК. Отобранные по маркеру CD 133 клетки обладают большим пролиферативным потенциалом, нежели при ранее использованных маркерах ГСК. Известно, что метастазы, являющиеся во многом причиной смертности от рака, зачастую обладают фенотипом стволовых клеток, и, в частности, несут на своей поверхности характерные маркеры. Иногда такие клетки называют "раковыми стволовыми клетками", благодаря неограниченной способности к делению, устойчивости к апоптозу и лекарствам. Идентификация таких клеток очень важна при прогнозировании и лечении онкозаболеваний. С другой стороны, многими
исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии. Выявление и изучение таких генов дает возможность выяснить причины болезни, пути ее диагностики и лечения.
Ген PROM1 имеет сложную систему регуляции транскрипции. Известно, что транскрипция гена PROM1 инициируется как минимум с пяти альтернативных промоторов, однако, как правило, транскрипция идет с двух основных промоторов: Р1 и Р2. Поскольку все промоторы renaPROMl входят в состав одного CpG-островка, предполагается, что одним из основных механизмов регуляции промоторов является метилирование.
По современным представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток в определенной степени способствует подтверждению этой гипотезы. Тщательный анализ данных по изучению экспрессии генов в клеточных линиях, являющихся производными раковых клеток, параллельно с определением экспрессии в эмбриональных и раковых тканях может иметь большое значение, как для клинической практики, так и для фундаментальной науки. Нами был проведен анализ уровня транскрипции генов в эмбриональных, нормальных взрослых и раковых тканях, поскольку многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии.
Известно, что при неоплазиях зачастую наблюдаются изменения в метилировании генов. На клеточных линиях, как модельном объекте, мы попытались определить существуют ли корреляции между уровнем метилирования потенциально регуляторных участков и экспрессией генов KLRB1 и PROM1.
Петли хроматина и метилирование ДНК
Показанная выше регуляция состояния уровня хроматина, путем перехода от "открытого" эухроматина к "закрытому" гетерохроматину открывает лишь один из возможных способов регуляции генов посредством химической модификации гистонов и цитозинов ДНК. В этом случае открытый хроматин позволяет присоединяться транс-активирующим факторам - это основной механизм регуляции генов (подробней рассмотрено далее в этом обзоре).
Тем не менее, для некоторых мультигенных кластеров была показана активация генов далеко отстоящими энхансерами, что было ассоциировано с образованием петель хроматина [30]. Основной предпосылкой для образования петель хроматина является его гибкость, обусловленная низким уровнем его организации [31]. Таким образом, модификации гистонов детерминируют возможность взаимодействия отстоящих энхансеров и родственных им генов.
Было показано, что гиперчувствительные сайты комплексного активатора транскрипции глобиновых генов (LCR), которые расположены на расстоянии 40-60 т.п.о. от активных генов, сближены в эритроцитах при экспрессии белков бета-глобинового локуса. В мозге, где экспрессия отсутствует — хроматин данного участка находится фактически в линейном состоянии [30]. Формирование и стабилизация петли хроматина требуют взаимодействия транс-действующих факторов, таких как, Kruppel-подобный фактор эритроцитов, гематопоэтический транскрипционный фактор GATA-1 и его кофактор Fog-І (цинк-фингерный белок) [32, 33]. Для LCR Т-хелперов типа 2 подобные энхансер-промоторные петли были показаны при экспрессии интрелейкинов IL-4,IL-5 и IL-13 в T- и NK-клетках, [34], и для энхансеров иммуноглобулина каппа в В-клетках мыши [35].
Кроме указанных энхансер-промоторных петель, существуют так называемые "parent specific" хроматиновые петли, которые были показаны для метилированных различным образом областей инсулин-подобного ростового фактора 2 и HI9 (IGF2/H19). В локусе IGF2/H19 мыши и человека содержатся сайты связывания для белка CTCF (см. ниже) - 4 и 7 сайтов, соответственно. Область, содержащая эти сайты и обладающая активностью инсулятора, названа DMR (Differently Methylated Region). На материнской аллели DMR служит для блокирования энхансера, активирующего транскрипцию гена Ig/2, поэтому Ig/2 не экспрессируется с материнской аллели. На отцовской хромосоме DMR находится в метилированном состоянии, поэтому белок CTCF не может связываться с областью DMR, что приводит к инактивации инсулятора. В результате Ig/2 экспрессируется с отцовской аллели [36].
Эти предпосылки легли в основу гипотезы "облегченного образования петель хроматина" [31]. Вероятно, в основе процесса сближения энхансера и промотора гена лежит ремоделирование хроматина - при понижении уровня организации хроматина (модификации гистонов и цитозинов ДНК) увеличивается его гибкость, и, становится возможным сближение отстоящих далеко друг от друга участков хроматина.
Рассмотренный ранее пример экспрессии с аллели только одного из родителей относится к явлению геномного импринтинга (от англ. imprint - оставлять отпечаток, след, запечатлевать). Геномный импринтинг - это механизм регуляции транскрипции, в результате которого группа генов млекопитающих экспрессируется только с одного из аллелей — материнского или отцовского.
Определенный характер распределения расположенных в промоторе метилированных остатков цитозина, свойственный отдельным генам, поддерживается после каждого акта репликации ДНК, то есть сохраняется в ряду клеточных поколений благодаря активности ДНК-метилтрансферазы, узнающей полуметилированные участки ДНК после репликации. Оказалось, что характер метилирования гена, регистрируемый в соматических клетках млекопитающих, стирается в процессе образования зародышевой ткани и гамет.
После оплодотворения и формирования зиготы происходит крупномасштабное деметилирование генома. Для эмбрионов мыши показано, что на стадии одной клетки после первого раунда репликации отцовские и материнские хромосомы группируются в отдельные кластеры [37]. По-видимому, деметилирование отцовских хромосом происходит раньше деметилирования материнских. Более того, отцовские хромосомы деметилируются по независимому от репликации механизму, тогда как материнские — по зависимому [18]. Статус импринтипговых генов, скорее всего, определяется либо на этом же этапе, либо ранее, во время гаметогенеза. Деметилирование заканчивается к моменту имплантации эмбриона, после чего осуществляется de novo метилирование ДНК с помощью белков DNMT1, DNMT3A и DNMT3B. В процессе дальнейшего роста организма метилирование поддерживается DNMT1, а при утрате метилирования в результате дезаминирования 5-метилцитозинов происходит его восстановление с помощью репарационного аппарата при участии MBD4. По-видимому, DNMT1 принимает участие и в распространении метилирования по геному.
Во многих случаях для аллельных генов, унаследованных от отца и матери, соответствующий рисунок метилирования устанавливается на ранних стадиях развития эмбриона. Оказывается, например, что ген, полученный от отца, сильнее метилирован и неактивен, тогда как гомологичный материнский ген активно транскрибируется
Хорошо изученный импринтинговый кластер — кластер 17А генома мыши. В этом участке находятся 3 гена, экспрессируемые в геноме матери - SLC22A2, SLC22A3 и IGF2R, и один, экспрессируемый в геноме отца, AIR, перекрывающийся с IGF2R [38]. В локусе IGF2R расположены 2 дифференциально метилированых участка (DMR), один из которых метилирован на экспрессируемой материнской хромосоме и, по-видимому, участвует в импринтинге [39]. Этот DMR находится в промоторе тепа AIR и в середине гена IGF2R. Экспрессируемый в отцовском геноме не кодирующий транскрипт AIR (анти-смысловой транскрипт для мРНК Igf2r) может подавлять транскрипцию IGF2R, связываясь с мРНК Ig/2r и вызывая ее деградацию [40]. После чего происходит сайленсинг и других материнских генов, возможно по механизмам описанным для поддомена KCNQ10T1. С другой стороны, РНК Air может распространяться в цис направлении к окружающим ее генам и с помощью белков ремоделирования и факторов сайленсинга приводить к гетерохроматшшзации.
Транскрипция в клеточных линиях
Ранее, в нашей лаборатории, была продемонстрирована обратная корреляция между изменениями уровней экспрессии ряда генов в процессе канцерогенеза разных тканей и при эмбриональном развитии соответствующих органов. В данной работе мы исследовали, существует ли такая же закономерность для уровней транскрипции генов KLRB1 и PROM1 на примере легочных тканей взятых у эмбрионов 10-12 и 21-24 недель. Это соответствует псевдогранулярной и каналикулярной стадиям развития легкого. Считается, что в это время иммунная система развита слабо, в то же время полипотентные и обладающие большим пролиферативным потенциалом клетки представлены широко. Данные по уровням транскрипции генов KLRB1 и PROM1 суммированы в таблице 2.
Транскрипты гена. PROM1, который экспрессируется способными к дифференцировке стволовыми клетками, детектируются на псевдогранулярной стадии развития, их уровень незначительно уменьшается к более поздней стадии развития. Наличие транскриптов гена во взрослом легком, по всей видимости, обуславливается различными циркулирующими в крови CD 133 -клетками.
Как и следует ожидать, ген KLRB1, кодирующий рецептор CD 161, экпрессируемый клетками иммунной системы, отсутствует на ранних стадиях развития, и лишь незначительное количество транскриптов появляется на более поздних стадиях. Для исследованных образцов тканей легкого взрослых людей показан довольно высокий уровень транскрипции гена KLRB1 (табл. 2). Такой уровень транскрипции гена, вероятно, обусловлен хорошо развитой иммунной системой взрослого человека. Таким образом, ген KLRB1 может использоваться как один из маркеров состояния иммунной системы человека.
Во многих случаях, у больных раком значительно подавлена иммунная система, и, в частности, снижена функция цитотоксических клеток. Можно предположить, что транскрипция гена KLRBJ также может быть супрессирована при неоплазиях.
Для определения уровня транскрипции гена использовали парные образцы опухолевой и прилегающей гистологически нормальной ткани, взятых от одних и тех же пациентов, что позволило исключить индивидуальную вариабельность уровней транскрипции генов. Образцы прилегающих к опухоли тканей рассматривали как условную норму. В качестве дополнительного контроля использовали образцы тканей легких и пищевода людей без патологий этих органов, умерших в результате травм.
Исследование уровня транскрипции гена KLRB1 провели на выборке образцов тканей 60 пациентов. 37 пар образцов были получены от пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого (26 - плоскоклеточный рак, 11 - аденокарцинома), 23 пары образцов получены от пациентов с диагнозом плоскоклеточный рак пищевода. Показано, что уровень транскрипции гена KLRB1 понижен в 25 опухолевых образцах (р 0,0001) по сравнению с нормой при немелкоклеточном раке легкого (68%) (табл. 3) и 13 образцах (р=0,0003) при плоскоклеточном раке пищевода (57%) (табл. 4). Одинаковый уровень транскрипции наблюдался в 10 парах образцов легкого (27%) и 10 парах образцов пищевода (43%). Для пищевода не было обнаружено случаев повышенной экспрессии гена KLRB1 в опухолевых образцах по сравнению с нормой, а в случае рака легкого, повышенная транскрипция гена KLRB1 детектировалась в 2 случаях (5%). Можно отметить, что в большинстве случаев, количество транскриптов KLRB1 было не менее чем в 8-10 раз выше в образцах нормальных тканей, по сравнению с опухолевыми. Поскольку принято считать, что гены могут быть маркерными для того или иного вида опухоли, если изменение уровня их транскрипции наблюдается не менее чем у 50% обследованных пациентов, полученные нами данные позволяют предположить, что ген KLRB1 может быть маркёром при немелкоклеточпом раке лёгкого и плоскоклеточном раке пищевода.
Буферные и другие растворы
Сопоставление уровней метилирования проанализированных промоторных областей и уровней транскрипции гена PROM1 показало, что метилирование участка промотора Р1 и 5 -UTR экзона 1А не коррелирует с транскрипционной активностью промотора. Уровень метилирования этого участка в исследованных клеточных линиях колеблется от 90% до 94%, то есть степень метилирования этого участка остается практически неизменной (табл. 6). В линии НЕК 293 с самым высоким уровнем транскрипции гена PROM1 этот участок практически не отличается по уровню метилирования (90%) от линии Jurkat с самым низким уровнем транскрипции гена (разница в количестве транскриптов гена PROM1 между этими линиями 1000 раз) и линии NGP, в которой не детектирована транскрипция гена (табл. 7). Таким образом, наши данные не подтверждают значение метилирования промотора Р1 для транскрипции гена PROM1 in vivo, а доказывают обратное, по крайней мере, для исследованных клеточных линий. Профили метилирования промотора Р2 и 5 -UTR экзона 1В можно разделить на две характерные группы - полуметилированные в линиях А549 и НЕК293, и полностью метилированные в линиях Jurkat и NGP (см. Рис. 20-21, табл. 6). Попадание в одну группу линий Jurkat и NGP, выглядит весьма логично, поскольку подтверждает гипотезу о супрессорной роли метилирования в регуляции активности промотора Р2. Транскрипты гена PROM1 в обеих линиях либо очень слабо представлены, либо отсутствуют.
Схожесть профилей метилирования линий А549 и НЕК293, в которых количество транскриптов отличается в 1000 раз (табл. 7), может указывать на то, что гипометилированное состояние промотора Р2 является необходимым, однако не достаточным условием для транскрипции гена PROM1 in vivo. Вероятно, необходимо участие дополнительных факторов, способствующих транскрипции гена PROM1. Таким образом, промотор Р2 регулируется метилированием in vivo, но транскрипционную активность промотора определяют другие факторы.
Искусственное метилирование последовательностей промоторов Р1 и Р2 в составе генно-инженерных конструкций показало влияние метилирования на промоторную активность на участке -1100/+10 промотора Р1 и промотор Р2. В обоих случаях исследователи наблюдали супрессию репортерного гена [185]. Однако наши данные не подтверждают ключевой роли метилирования в регуляции транскрипции гена промотора Р1, и лишь частично для промотора Р2. Ранее показано изменение свойств гистонов при регуляции транскрипции гена PROM1 [194], как известно, изменение химической модификации гистонов, вкупе с химическими модификациями цитозинов влияют на свойства хроматина (см. Обзор литературы). Таким образом, можно предположить, что в регуляции гена PROM1 происходит ремоделирование хроматина, которое может сближать промоторную область с регуляторными последовательностями, например энхансером. С другой стороны, поскольку высказывалось предположение о разноаллельнои транскрипии гена PROM J, то возрастает вероятность того, что это импринтируемый ген.
Анализ метилирования промоторов Р1 и Р2 в клеточных линиях показал тканеспецифичность метилирования промотора Р2 и фактически отсутствие таковой специфичности для промотора Р1. Различия в профилях метилирования исследованных промоторов могут служить косвенным доказательством того, что при их регуляции используются различные механизмы. Таким образом, метилирование является лишь одним из факторов, определяющих активность некоторых промоторов. 2.2.5 Определение метилирования в протяженных участках генов KLRB1 и PROM1.
Нами были исследованы не только промоторные области генов PROM1 и KLRB1, но и протяженные области обоих генов от первых экзонов в 1-3 т.п.о. в 5 -направлении, до вторых-третьих экзонов этих генов, на предмет наличия CpG-островков и потенциально регуляторных элементов. В этих областях были обнаружены LTR, AluSp и прочие GC-богатые элементы.
Был проанализирован уровень метилирования LTR и GC-богатых участков первых интронов генов модифицированным методом бисульфитного секвенирования как описано ранее [193]. Выделенную ДНК обрабатывали рестриктазой EcoRI (NEB, England) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученный рестрикт денатурировали 10 минут при +95С и сразу охлаждали во льду. Добавляли NaOH до конечной концентрации О.ЗМ и инкубировали 20 минут при +50С. После чего смешивали с 2%-й легкоплавкой агарозой в соотношении 1:2 и формировали агарозные шарики в охлажденном (лед) минеральном масле. Содержание ДНК в одном шарике составляло 10 нг. Бисульфитную реакцию проводили при +50С в течении 5-6 часов, в смеси содержащей 3.5М метабисульфита натрия и 200тМ гидрохинона, предварительно реакционная смесь титровалась 5М NaOH до рН«5. Остановку реакции проводили так же как описано выше.
Амплификацию CG-богатых областей генов и фланков LTR проводили в два этапа на приготовленных ранее агарозных шариках с обработанной ДНК. Уникальные праймеры были расположены следующим образом. При первой ПЦР - происходит амплификация более длинного фрагмента с внешними праймерами, а при второй ПЦР -происходит амплификация целевой последовательности для секвенирования. Для CG-богатых участков генов был сделан "полу-гнездовой" ПЦР с использованием трех уникальных праймеров (одна внешняя пара + дополнительный внутренний праймер, см. Таблицу 8). Для CG-богатых участков генов был сделан полный "гнездовой" ПЦР с использованием четырех уникальных праймеров (одна пара внешних и одна пара внутренних праймеров).
Проводили сиквенс ПЦР продукта полученного в результате амплификации обработанного бисульфитом генома (рестрикт EcoRI). Полноту прохождения бисульфитной реакции проверяли по одиночным цитозинам. Во всех случаях она составляла не менее 90-95%. Полученные данные представлены на рисунке 23.
Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР
Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли при помощи пакетов программ Draft Human Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlafl и National
Center for Biotechnology information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Дизайн праймеров проводили с использованием программы РгітегЗ WWW сервера Whitehead Institute (http://www-genonie.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 www.cgp и программы Gene Runner (Ver 3.00). При создании специальных праймеров для бисульфитного секвенирования использовали программу MetPrimer ( http://www.urogene.org/methprimer/index 1 .html).
CG-богатые области генов PROM1 и KLRB1 были отсеквеиированы при помощи модифицированного метода бисульфитного сиквенирования как описано ранее [193]. Проводили сиквенс ПЦР продукта полученного в результате амплификации обработанного бисульфитом генома (рестрикт EcoRI).
Полноту прохождения бисульфитной реакции проверяли по одиночным цитозинам. Расположение праймеров:
При первой ПЦР - происходит амплификация более длинного фрагмента с внешними праймерами, а при второй ПЦР - происходит амплификация целевой последовательности для секвенирования. Для CG-богатых участков генов был сделан "полу-гнездовой" ПЦР с использованием трех уникальных праймеров (одна внешняя пара + дополнительный внутренний праймер). Для CG-богатых участков генов был сделан полный "гнездовой" ПЦР с использованием четырех уникальных праймеров (одна пара внешних и одна пара внутренних праймеров).
Участок содержащий промоторы Р1 и Р2 гена PR ОМІ был отсиквенировап при помощи описанного ранее метода бисульфитного сиквенирования [193], который мы дополнили и изменили для исчерпывающего прохождения бисульфитной реакции (в стандартных условиях реакция не проходит - результаты не указаны). Выделенную ДНК обрабатывали рестриктазой EcoRI (NEB, England) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученный рестрикт денатурировали 10 минут при +100С и сразу охлаждали во льду. Добавляли NaOH до конечной концентрации О.ЗМ и инкубировали 20 минут при +50С. После чего смешивали с 2%-й легкоплавкой агарозой в соотношении 1:2 и формировали агарозные шарики в охлажденном (лед) минеральном масле. Содержание ДНК в одном шарике составляло 10 нг. Бисульфитную реакцию проводили при +50С в течении 16 часов, в смеси содержащей 3.5М метабисульфита натрия и 200тМ гидрохинона, предварительно реакционная смесь титровалась 5М NaOH до рН«5. Остановку реакции проводили шестикратной отмывкой 1мл ТЕ буффера по 15 минут, десульфонирование - два раза 0,5мл О.ЗМ NaOH по 15минут, две отмывки 1мл ТЕ буфера по 15 минут и финальная отмывка 1мл деионизированной водой два раза (15 минут). Последний раз агарозные шарики с обработанной ДНК оставляли в воде и хранили на +4С.
Амплификацию участка промоторной области проводили в два этапа на приготовленных ранее агарозных шариках с обработанной ДНК. На первом этапе использовались внешние специфические праймеры Bis-For и Bis-Rev фланкирующие анализируемый участок, режим проведения ПЦР, в объеме 25 мкл, следующий: денатурация 95С/10 минут, после чего добавляли полимеразу и проводили 40 циклов амплификации в режиме 94С/30 сек, 54С/30 сек, 72С/60 сек, затем проводили достройку при 72С/5 минут. Полученную смесь разводили в 10 раз и использовали из нее 2 мкл, для постановки второго этапа ПЦР, в объеме 50 мкл, с использованием внутренних специфических праймеров Bis-ForN и Bis-RevN в следующем режиме: денатурация 95 С/10 минут, после чего добавляли полимеразу и проводили 36 циклов амплификации в режиме 94С/30 сек, 51С/30 сек, 72С/50 сек, затем проводили достройку при 72С/2 минуты. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле, полоса нужного размера вырезалась и реамплифицировалась в объеме 25 мкл, со внутренних праймеров, в следующем режиме: денатурация 94С/2 минуты, 12 циклов амплификации в режиме 94С/30 сек, 51С/30 сек, 72С/50 сек, затем проводили достройку при 72С/2 минуты. Полученная смесь лигировалась в вектор pGEM (Promega), который трансформировался в E.Coli согласно протоколу производителя. Клоны, содержащие нужную вставку, сиквенировались с плазмидных праймеров Т7 и Sp6. Для каждой из выбранных клеточных линий было отсиквенировано не менее 10 индивидуальных клонов для определения статуса метилирования каждой CpG-пары в анализируемом участке. Полноту прохождения бисульфитной реакции проверяли по одиночным цитозинам, она составляла не менее 97%.
Использовали следующую реакционную смесь для лигирования: 2х лигазный буфер, 3 нг вектора pGEM-5Zf(+), 13.3 нг ПЦР продукта, 3 единицы Т4 лигазы; объем реакции 10 мкл, лигирование проводили в течение ночи при 4 С, либо при +22С в течении 2 часов с добавлением в реакционную смесь 1 мкл PEG4000. Продукты амплификации клонировали в Е. coli штамма DH5a с использованием набора реактивов "TA-cloning system" (Promega). Реакцию лигирования проводили как описано выше. 2 мкл лигата добавляли к 200 мкл компетентных клеток Е. coli штамма DH5a, выдерживали на льду в течение 30 мин., затем прогревали 30 сек. при 42С, объем доводили до 1 мл средой LB и выдерживали при 37 С 1 час. Аликвоты по 50 и 100 мкл клеток рассевали на чашки с LB-агаром (содержали Amp, X-Gal, IPTG) и растили ночь при 37С. Отдельные колонии пересевали в стеклянные пробирки, содержащие 5 мл LB с ампициллином, растили ночь при 37 С.
