Введение к работе
Актуальность проблемы.
Развитие интерактомики определяет возможность разработки методов целенаправленного вмешательства в процессы специфического взаимодействия, и тем самым обеспечивает создание теоретических основ для направленного синтеза лекарств нового поколения.
Нуклеиново-белковые взаимодействия играют важную роль во многих клеточных процессах, среди которых особое место занимает биогенез рибосом. Рибосома - это многокомпонентный супрамолекулярный РНК-белковый комплекс, способный к самосборке даже in vitro. На биогенез рибосом (который включает в себя синтез рРНК и рибосомных белков (р-белков), а также их сборку) быстрорастущие клетки бактерий затрачивают около половины всех своих ресурсов. Биогенез рибосом достаточно строго регулируется с помощью РНК-белковых взаимодействий. Биогенез малой субчастицы рибосом Е. coli регулируется белками S7 и S4. S7 инициирует самосборку субчастицы in vitro, взаимодействуя с локальным участком основного 3'-концевого домена 16S рРНК. S7 транслируется с цистрона rpsG в составе стрептомицинового (str) оперона. В str-оиероя входят цистроны р-белков S12 (rpsL) и S7 (rpsG), фактора элонгации трансляции EF-G (fits), а также одна из двух копий гена фактора элонгации трансляции EF-Tu (tu/A), который имеет два собственных промотора (рис. 1).
Изучение str-опероиа важно с прикладной точки зрения. Хромосомные мутации белка S12 приводят к фенотипу зависимости/устойчивости к str, что определило название оперона. Поскольку str в практической деятельности используется давно, картирование таких мутаций необходимо для развития популяционной микробиологии.
Интересной редкой особенностью str-опероиа Е. coli является наличие протяженного участка мРНК длиной 96 нуклеотидов (н) между цистронами S12 и S7 (т.н. межцистронный участок, МЦУ). Несмотря на то, что цистроны S12 и S7 так сильно разобщены физически, трансляция S7 сопряжена с трансляцией предшествующего S12, т.е. происходит строго последовательно. В отсутствие синтеза 16S рРНК, когда регулон рРНК выключен, избыток экспрессируемого S7 взаимодействует с МЦУ str мРНК и ингибирует собственную трансляцию, а также трансляцию последующего цистрона фактора элонгации EF-G. Таким образом, актуальной является задача по выявлению структурных мотивов РНК, определяющих узнавание разных РНК одним белком.
Согласно компьютерному поиску, проведенному нами в более чем сотне секвенированных геномов, оказалось, что str-оперои Е. coli - нетипичный: аналогичный протяженный МЦУ в str-оперонах имеют только около трети бактерий. У остальных бактерий МЦУ либо меньше, размером ~40 н., либо его вообще нет. По этому признаку мы условно разделили бактерии на 3 группы. Изучение механизмов регуляции трансляции зґг-оперонов у бактерий из разных групп актуально с прикладной точки зрения, поскольку патогены встречаются во всех трех группах. Найденное различие дает возможность селективно вмешиваться в самосборку рибосом, а, следовательно, и в жизнедеятельность только определенных видов бактерий.
В связи с изложенным, возникает необходимость разработки специальных подходов для поиска неизвестных регуляторных элементов мРНК, взаимодействующих с регуляторными р-белками. Несмотря на различия в структурной организации оперонов, сами белки S7 высоко консервативны, поэтому изучение различных оперонов расширит знания структурных мотивов, узнаваемых белком.
Цель работы. Детальное изучение РНК-белковых взаимодействий в str-оперопе Е. coli. Позиционирование зґг-оперона Е. coli среди других оперонов бактерий. Поиск мотива РНК, узнаваемого рибосомным белком S7.
Были поставлены и выполнены следующие задачи:
Аннотация структуры зґг-оперонов бактерий, геномы которых секвенированы. Поиск регуляторных участков РНК в двух типах оперонов: str-опероне Е. coli (длина МЦУ 96 н.) и str-опероне S. coelicolor (длина МЦУ 2 н.) методом селекции случайных участков мРНК (оперона) (SERF). Определение аффинности белков S7 из Е. coli (EcoS7), S. coelicolor (ScoS7) и Т. thermpohilus (TthS7) к участкам различных РНК методами сорбции на нитроцеллюлозных мембранах, поверхностного плазмонного резонанса и капиллярного гель-электрофореза в микрочиповом варианте. Поиск узнаваемого S7 мотива РНК, уникального для всей узнаваемой группы РНК
Научная новизна и практическая значимость
В настоящей работе впервые высказана гипотеза о структуре узнаваемого S7 мотива РНК -т.н. Е-мотива. На основании построенной пространственной модели комплекса МЦУ с S7 высказана гипотеза о механизме регуляции сопряженной трансляции цистронов S12 и S7. Методами биоинформатики впервые показано, что str-оперои Е. coli не является типичным для эубактерий; это актуализирует изучение зґг-оперонов других бактерий, особенно тех, которые не имеют МЦУ. Практическая значимость работы определяется двумя обстоятельствами:
необходимостью изучения популяционной генетики устойчивости к str, а также возможностью селективно вмешиваться в жизнедеятельность различных групп бактерий.
Апробация работы. Материалы работы были представлены и апробированы на 10 отечественных и международных конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа (140 страниц) состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (100 источников), содержит 81 рисунок и 7 таблиц.
