Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусные транс-активирующие белки Tat и Rev необходимы для репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) . Функции этих белков являются связанными и дополняют друг друга. Tat увеличивает уровень транскрипции вирусного генома, в то время как Rev отвечает за эффективную экспрессию в цитоплазме поздних мРНК, кодирующих вирусные ферменты и структурные белки. Потеря активности любым из этих двух белков приводит к полной остановке инфекции.
Указанные белки являются РНК-связываюшнми и узнают двутяжевые участки с определенной нуклеотндной последовательностью. Мишень для Tat - 59-звенная шпилечная структура (TAR), расположенная на 5'-конце всех мРНК транскриптов ВИЧ. Для проявления активности Rev также необходима разветвленная шпилечная РНК-структура длиной 351 нуклеотид (RRE), расположенная внутри кодирующей последовательности гена белка оболочки (env) ВИЧ. Эта протяженная последовательность может связывать одновременно до 11 молекул Rev белка.
Построение полной картины развития ВИЧ-инфекции в клетке и создание анти-ВИЧ терапевтических препаратов в существенной степени зависит от наличия информации о пространственной организации белок-РНК комплексов Tat-TAR и Rev-RRE. Несколько крупных лабораторий мира занимаются проблемой установления структуры этих комплексов методами рентгеноструктурного анализа и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. До настоящего времени не решена проблема получения комплексов Tat-TAR и Rev-RRE в виде монокристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Методом спектроскопии ЯМР с последующим компьютерным моделированием к настоящему моменту установлены пространственные структуры TAR РНК и RRE РНК в комплексе с Rev-пептидом. Однако построить полную структуру комплекса РНК-белок на основании данных ЯМР затруднительно. Для однозначного отнесения всех сигналов спектра ЯМР и для подтверждения корректности рассчитанных моделей требуются дополнительные данные по контактам РНК-белок, полученные с помощью биохимических методов.
Из биохимических методов наиболее точную информацию по контактам белок-НК позволяет получить метод ковалентного связывания. В лаборатории Химии
Здесь и далее ВИЧ обозначает вирус иммунодефицита человека первого типа.
- 2-нуклеиновых кислот МГУ был предложен новый тип реагентов для ковалентного связывания НК с белками: олигонуклеотиды, содержащие в заданном положении сахаро-фосфатного остова химически активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу (ТЗП). В составе комплекса с белком такие реагенты способны фосфорилировать нуклеофильные группы белка, пространственно сближенные с данной межнуклеотидной связью. Однако до настоящего времени синтез реагентов, содержащих ТЗП, был разработан только для олигодезоксирибонуклеотидов и, соответственно, соединения этого типа использовались для изучения только ДНК-узнаюших белков.
Настоящая работа посвящена синтезу реагентов подобного типа на базе олигорибонуклеотидов и их применению для изучения контактов в РНК-белковых комплексах Tat-TAR и Rev-RRE.
Целью настоящей работы явилось:
-
разработка синтеза олигорибонуклеотидов, содержащих активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу методом химического лигирования (ХЛ);
-
отработка условий специфичного ковалентного связывания фрагментов таких активных РНК с регуляторными белками Tat и Rev ВИЧ;
-
установление аминокислотных остатков Tat и Rev, контактирующих с межнуклеотидными фосфатными группами в определенных положениях TAR и RRE дуплексов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Изучена эффективность реакций химического лигирования в РНК и РНК-ДНК дуплексах. Исследована зависимость выхода продукта конденсации от структуры дуплекса и положения рибо- и дезоксирибо-фрагментов в дуплексе, а также от природы функциональных групп, сближенных в реакционном узле.
Установленные закономерности химического лигирования позволили впервые осуществить синтез РНК-дуплексов, содержащих активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу. Проведено изучение взаимодействия олигонуклеотидов, содержащих тризамещенный пирофосфат, с модельными соединениями, содержащими функциональные группы боковых цепей аминокислот. Установлена высокая реакционная способность этих соединений в реакциях с первичными алифатическими аминами и имидазолом, что показывает возможность их использования для ковалентного связывания с аминокислотными остатками белка, содержащими указанные группировки.
Полученные в работе двутяжевые РНК, содержащие тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу, в участках узнавания (TAR н RRE) регуляторных белков ВИЧ Tat и Rev, были использованы для изучения природы взаимодействий в комплексах Tat-TAR и Rev-RRE. Установлены три положения в сахаро-фосфатном остове TAR, введение в которые активной группы приводит к эффективному ковалентному связыванию Tat, что свидетельствует об участии фосфатов в этих положениях в прямых контактах с остатками лизина РНК-связываюшего участка Tat. Для одного из этих положений - фосфата, расположенного между уриднном 38 и цитидином 39 TAR (р38-39), - установлено, что этот фосфат контактирует с Е-аминогруппой Lys51 Tat. Для определения природы аминокислоты впервые использован метод избирательного расщепления ковалентносвязанного комплекса протеазами с последующим анализом продуктов протеолиза MALDI TOF масс-спектрометрией.
Эффективный синтез и успешное применение РНК, содержащих активные группы, для изучения пространственной организации Tat-TAR комплекса открывают новые возможности для изучения РНК-узн'ающих белков и принципов РНК-белковых взаимодействий.
Легкость получения и высокая эффективность ковалентного связывания ТЗП-содержащих олигорибонуклеотидов с регуляторными белками ВИЧ позволяют использовать эти соединения для селективного ингибирования этих белков, что может быть использовано при создании терапевтических анти-ВИЧ препаратов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи и одна принята к публикации. Результаты работы были доложены на первом Европейском биотехнологическом симпозиуме (серия Майами Bio/Technology) (Монако,
1994 г.) и на четвертом курсе лекций Европейского союза биохимических обществ
(FEBS) "Взгляд молодых ученых на молекулярную биотехнологию" (г. Льеж, Бельгия,
1995 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит Хт^ рисунков и таблиц.
