Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЭФФЕКТИВНАЯ АЭРАЦИЯ - ОСНОВА АЭРОБНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 9
1.1. Влияние кислорода на культивирование микроорганизмов 9
1.2. Модели массопередачи 17
1.3. Транспорт кислорода через непористую полимерную мембрану 27
1.4. Способы получения кислорода и обогащенного кислородом
воздуха 39
Постановка задачи исследования 48
ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ МАССОПЕРЕНОСА КИСЛОРОДА ЧЕРЕЗ СИЛИКОНОВУЮ МЕМБРАНУ 50
2.1. Материалы и методы 50
2.2. Результаты и их обсуждение 53
2.3. Математическое описание массопереноса кислорода через 59
мембрану
2.4. Изучение массопереноса кислорода через мембрану в условиях 64
модельной химической реакции
Выводы 70
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КУЛЫГОИРОВАНИЯ СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ В АЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ В МЕМБРАННОМ БИОРЕАКТОРЕ 71
3.1. Материалы и методы аналитического контроля 71
3.1.1. Состав питательной среды для аэробного культивирования спиртовых дрожжей 71
3.1.2. Физико-химические условия культивирования спиртовых дрожжей 74
3.1.3. Методы измерения количества и концентрации спиртовых дрожжей 75
3.1.3.1. Измерение числа клеток 75
3.1.3.2. Методика определения концентрации биомассы весовым методом 76
3.1.3.3. Определение концентрации биомассы дрожжей методом оптической плотности 76
3.1.3.4. Определение микробиологической чистоты дрожжевой культуры. 77
3.1.4. Определение содержания Сахаров по Бертрану 77
3.2. Описание экспериментальных установок 79
3.2.1. Описание конструкции лабораторного мембранного биореактора с рабочим объемом 0,5 литра 79
3.2.2. Описание конструкции автоматизированной ферментационной установки на основе мембранного биореактора с рабочим объемом 1 литр 80
3.3. Результаты и их обсуждение 84
3.3.1. Культивирование спиртовых дрожжей в мембранном биореакторе при аэробных условиях периодическим способом 84
3.3.2. Культивирование спиртовых дрожжей в мембранном биореакторе при аэробных условиях отъемно-доливным способом 89
3.3.3. Культивирование спиртовых дрожжей в мембранном биореакторе при аэробных условиях непрерывным способом 91
Выводы 93
ГЛАВА 4. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ В МЕМБРАННОМ БИОРЕАКТОРЕ 94
4.1. Материальный баланс углекислого газа и кислорода 95
4.2. Параметры метаболических процессов 96
4.3. Кинетическая модель роста дрожжей и метаболические скорости. 101
4.4. Результаты моделирования 104
4.5. Моделирование непрерывного процесса культивирования спиртовых дрожжей в аэробных условиях в мембранном биореакторе 109
Выводы 115
ГЛАВА 5. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ РАСЧЕТ СИСТЕМЫ ОБОГАЩЕНИЯ ВОЗДУХА КИСЛОРОДОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИДКИХ ПАССИВНЫХ МЕМБРАН 116
5.1. Технология обогащения воздуха кислородом с использованием жидких пассивных мембран 116
5.2. Расчет системы обогащения воздуха кислородом с помощью
моделирующей программы ChemCad 118
Выводы 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 127
ЛИТЕРАТУРА 128
СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 139
ПРИЛОЖЕНИЯ 144
- Влияние кислорода на культивирование микроорганизмов
- Материалы и методы
- Материалы и методы аналитического контроля
Введение к работе
Традиционное выращивание дрожжей в спиртовом производстве осуществляется в анаэробных условиях при относительно низких скоростях роста и повышенном удельном расходе субстрата. Расход субстрата на дрожжегенерацию при этом составляет до 5% всех сбраживаемых Сахаров, содержащихся в среде. Анаэробное культивирование дрожжей осуществляют поэтапно путем их размножения во всевозрастающих количествах сусла и пересевом активно бродящих дрожжей из меньших объемов в большие. При этом узел дрожжегенерации часто является существенным источником инфекции [1], развитие которой наносит значительный ущерб спиртовому производству: нарушает нормальный ход технологического процесса, уменьшает выход готовой продукции, ухудшает его качество.
Дальнейшее развитие инфицирующей микрофлоры происходит в бродильных чанах, что приводит к сверхнормативному нарастанию кислотности, способствующей снижению выхода и ухудшению органолептических показателей спирта. Повышенная кислотность бражки уменьшает активность декстриназной системы, останавливает процесс брожения при повышенном содержании несброженных углеводов. При периодическом способе дрожжегенерации обычно вводят серную кислоту для снижения рН до 3,0-3,5, что препятствует чрезмерному накоплению бактериальной микрофлоры при длительной многократной рециркуляции (отъемах) дрожжей. Однако, повторяющаяся при каждой операции обработка серной кислотой ведет к ослаблению продуцента, частичной гибели клеток с накоплением продуктов автолиза, развитию посторонних («диких») дрожжей, которые трудно идентифицируются в условиях производственных лабораторий. В то же время их доля может достигать 60% от популяции дрожжей. Присутствие «диких» дрожжей заметно снижает выход и ухудшает качество спирта [1]. Одним из основных способов снизить уровень инфицирования спиртового производства, повысить активность дрожжей является выращивание чистой культуры спиртовых дрожжей в стерильных условиях по интенсивной технологии, дающей высокую плотность дрожжевой популяции. Новый подход к проблеме выращивания чистой культуры спиртовых дрожжей, предложенный В.М Емельяновым, Филипповой Н.К. и др., заключается в наращивании биомассы дрожжевой популяции в аэробных условиях на стерильной питательной среде, поскольку именно аэрация культуральной жидкости, снабжение дрожжей кислородом, является ключевым фактором, способствующим накоплению активной биомассы, а стерильные условия ведения процесса резко снижают вероятность заражения посевного материала посторонней микрофлорой, повышают качество засевной культуры [2]. Аэробная технология получения чистой культуры спиртовых дрожжей [3] позволит сохранить селективные свойства исходного промышленного штамма, будет препятствовать постепенному вытеснению высокопродуктивной части популяции дрожжей малопродуктивной. Производимые в аэробных условиях дрожжи обладают высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот и трегалозы, что обеспечивает им высокую спиртотолерантность.
Реализация более эффективных аэробных процессов культивирования дрожжей сопряжена с проблемой обеспечения асептических условий подвода кислорода и низкой степенью извлечения кислорода из барботируемого газа.
При глубинном культивировании аэробных микроорганизмов требуется непрерывная подача кислорода в ферментеры, осуществляемая путем продувания стерильного воздуха через культуральную жидкость. Воздух, подаваемый на аэрацию, должен быть очищен на 99,9% от примесей и микроорганизмов размером до 1 мкм. Наибольшее распространение получил метод фильтрации воздуха через волокнистые (стекловата, базальтовое волокно, бумага, картон), пористые (полимеры, металлокерамика) или зернистые материалы, но и он не обеспечивает нужной степени очистки.
Для лучшего диспергирования воздух пропускают через барботеры. Как правило, аэрацию совмещают с механическим перемешиванием [4]. Однако, при аэрации воздухом культуральной жидкости только некоторая часть кислорода переходит в раствор, а остальное количество не используется [3].
Единственным экономически приемлемым в широких масштабах источником кислорода в настоящее время является воздух, хотя в некоторых случаях не исключается целесообразность применения и чистого кислорода [5]. Соответственно - низкая равновесная концентрация кислорода в культуральной жидкости при аэрации воздухом (5-7 мг/л) и необходимость обеспечения интенсивной массопередачи при фазовых переходах газ-жидкость и жидкость-клетка [6]. Требуются разработки новых подходов к проблеме аэрации для повышения эффективности дрожжегенерации в спиртовом производстве.
Настоящая работа посвящена разработке интенсивной аэробной технологии дрожжегенерации в мембранном биореакторе. Новый подход к проблеме аэрации в процессе аэробного выращивания посевных материалов в спиртовом производстве заключается в подаче чистого кислорода или обогащенного кислородом воздуха в биореактор через непористые полимерные мембраны-шланги. При этом гарантированно обеспечивается стерильность газового потока. Кроме того, поток газа через мембрану дробится до уровня отдельных молекул, непосредственно захватываемых жидкостью без образования газовой фазы в случае применения чистого кислорода, практически полностью потребляемого культурой. Использование чистого кислорода становится экономически оправданным и за счет пятикратного увеличения движущей силы процесса массопередачи. Конечно, интенсивность массопередачи кислорода в мембранном реакторе не достигает предельных значений, характерных для аппаратов с барботажными устройствами, но для целей получения плотного посевного материала оказывается достаточной.
С целью снижения затрат в работе предлагается вместо чистого кислорода при дрожжегенерации в мембранном биореакторе использовать обогащенный кислородом воздух. Рассмотрены технологические условия обогащения воздуха кислородом и рассчитана схема, позволяющая получить заданную степень обогащения воздуха кислородом на жидких пассивных мембранах.
Работа выполнялась в соответствии с межрегиональными научно-техническими программами «Биотехнология» (1996-1997 гг.) и «Научные исследования высшей школы по технологии живых систем» (2000 г.), «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям» (2003-2004 гг.).
Автор выражает глубокую признательность за научное руководство проф. Емельянову В. М. и докторанту Мухачеву С. Г. и благодарит за помощь в работе над диссертацией Владимирову И. С, Валееву Р. Т., Филлипову Н. К. и Сафронова А. М.
Влияние кислорода на культивирование микроорганизмов
В зависимости от отношения микроорганизмов к молекулярному кислороду их принято делить на облигатные аэробы, факультативные анаэробы, аэротолерантные анаэробы и облигатные анаэробы. Большинство микроорганизмов, как и макроорганизмы, являются облигатными аэробами, для роста им необходим молекулярный кислород. Наряду с этим есть микроорганизмы, которые хотя и нуждаются в наличии кислорода, но могут расти или лучше растут при низком его содержании (2-10%). Такие микроорганизмы называют микроаэрофилами, а условия, в которых они растут, микроаэробными. Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсутствии кислорода. Но в зависимости от условий роста происходят изменения в их метаболизме, прежде всего в энергетических процессах. Процесс роста и размножения требует затрат энергии, которая может быть получена в результате брожения или дыхания. Примером могут служить некоторые дрожжи, способные осуществлять в анаэробных условиях спиртовое брожение, а в аэробных полностью окисляющие в процессе дыхания сахара с образованием углекислого газа и воды.
Наиболее примитивным способом получения энергии являются процессы брожения. Поскольку брожение протекает без участия молекулярного кислорода, все окислительно-восстановительные превращения субстрата происходят за счет его «внутренних» возможностей. Процесс брожения связан с такими перестройками органических молекул субстрата, в результате которых на окислительных этапах процесса высвобождается часть свободной энергии, заключенной в молекуле субстрата, и происходит ее аккумулирование в молекулах макроэргических соединений, например АТФ [10]. Примитивность процессов брожения заключается в том, что из субстрата в результате его анаэробного преобразования извлекается лишь незначительная доля той химической энергии, которая в нем содержится. В анаэробном процессе глюкоза расщепляется до пирувата по гликолитическому пути, и далее пируват через ацетальдегид превращается в этанол. Процесс спиртового брожения суммарно можно выразить следующим уравнением:
С6Н12Об + 2ФН + 2АДФ 2СН3-СН2ОН + 2СО2 +2АТФ +2Н2О (1.1) Как видно из уравнения, с точки зрения энергетического выхода сбраживание одной молекулы глюкозы приводит к образованию двух молекул АТФ.
При наличии молекулярного кислорода факультативные анаэробы переключаются на окисление субстрата с участием кислорода, т.е. на аэробное дыхание, поскольку оно более выгодно, чем получение энергии в результате анаэробных процессов. В аэробных условиях образующийся пируват превращается в ацетил-КоА, а затем через цикл трикарбоновых кислот окисляется до СО2 и воды:
C6Hi2O6 + 6О2 + 38ФН + 38АДФ 6СО2 + 6Н2О + 38АТФ (1.2)
При аэробном дыхании из одной молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ.
Количество АТФ, требуемое для биосинтеза, одинаково вне зависимости от того, растут клетки в аэробных или анаэробных условиях, поэтому в анаэробном метаболизме для производства такого же количества клеточного материала дрожжам необходимо утилизировать гораздо больше глюкозы [11]. Затраты сахара на синтез 100 млрд. клеток дрожжевой массы, выращенной анаэробно, составляет 8 г, при слабой аэрации - 3 г, т. е. в 2,5 раза меньше [12].
Материалы и методы
Производительность мембраны как средства транспорта веществ определяется, в значительной степени, механическими, химическими и физическими свойствами материала мембраны. Цилиндрические мембраны-шланги, пригодные для обеспечения кислородом культуры в процессе дрожжегенерации, выполняются в виде композиционных или гомогенных мембран. Такие мембраны могут быть пористыми и непористыми (мембраны растворимости).
Для беспузырькового ввода кислорода могут применяться только мембраны растворимости, избирательно проницаемые для молекул кислорода [58]. В качестве сырья для изготовления таких мембран используются, главным образом, полимерные материалы: природные (ацетатцеллюлоза, нитрацеллюлоза, регенерат целлюлозы и др.) или синтетические (полиакрилнитрил, полиэтилен, политетрафторэтилен, полидиметилсилоксан и др.).
Пермеабельность мембраны в отношении кислорода в газовой и жидкой фазе определяет производительность транспорта кислорода через мембрану. Химическая стабильность мембраны определяется сырьем, из которого она изготовлена. Механические свойства мембраны ограничивают допустимый перепад давлений с разных сторон мембраны и, таким образом, определяют реализуемую величину движущей силы процесса массопереноса.
Выбор материала мембраны определяется не только оценкой проницаемости по кислороду, но и условиями эксплуатации, в частности, требованиями термической стерилизации.
В настоящей работе в качестве мембраны для переноса кислорода в культуральную жидкость использовался полидиметилсилоксан. Он обеспечивает высокую растворимость кислорода [98]. Парциальное давление кислорода в жидкости составляет 0,1929 гмм/час-Па-мм2 [99]. Пермеабельность мембран из полидиметилсилоксана как отношение между избирательной проницаемостью кислорода и азота составляет 2-5:1. Химическая стабильность полидиметилсилоксана в водных растворах весьма велика. Температура стеклования равна -123С, что значительно ниже рабочей температуры мембраны, т. о. мембрана работает в высокоэластическом состоянии. Механическая прочность шланга при толщине стенки 0,7 мм допускает перепад давлений с разных ее сторон от 122 до 125 кПа [58].
Материалы и методы аналитического контроля
Для получения полноценной биомассы дрожжей в культуральной жидкости должны находиться все требуемые для синтеза клеточного материала вещества в достаточном количестве. О потребности дрожжей в питательных веществах судят по их химическому составу, зависящему от питательной среды, условий культивирования дрожжей и их физиологических особенностей. Средний элементарный состав дрожжевых клеток (%): углерод 47, водород 6,5, кислород 31, азот 7,5-10, фосфор 1,6-3,5. Содержание других элементов незначительно (%): кальция 0,3-0,8, калия 1,5-2,5, магния 0,1-0,4, натрия 0,06-0,2, серы 0,2. В дрожжах найдены микроэлементы (мг/кг): железо 90-350, медь 20-135, цинк 100-160, молибден 15-65 [19].
В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах [106]. В питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка, в легкоусвояемом виде. Она должна содержать источники углерода и азота - вещества, необходимые для конструктивного и энергетического метаболизма.
Спиртовые дрожжи в качестве источника углерода используют глюкозу, манозу, галактозу, мальтозу, фруктозу. В процессе дрожжегенерации углеводы расходуются главным образом на получения трех основных продуктов: дрожжей, спирта, диоксида углерода.
Расход сахара на дыхание дрожжей в процессе дрожжегенерации составляет 6-15% от общего его расхода в этом процессе или 2-5% от всех сбраживаемых Сахаров, содержащихся в среде дрожжегенераторов [19]. Расход сахара на дыхание зависит от концентрации его в среде, скорости насыщения среды кислородом, температуры и т.д. С повышением концентрации сахара от 1 до 4% количество углерода, используемое на построение биомассы, увеличивается с 52-55 до 60-61% и соответственно уменьшается на образование СОг при дыхании, т.е. процесс становится экономичным.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae усваивают лишь две формы азота: аммиачный и органических веществ. Эти микроорганизмы эффективно используют азот сульфата и фосфата аммония, мочевины, аммиачных солей уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот. На образование 10 млрд. дрожжевых клеток расход азота в условиях аэробиоза составляет 37-53 мг [19].
Для нормального развития дрожжи нуждаются в витаминах, которые являются кофакторами многих ферментов. Сахаромицеты в большей или меньшей степени могут синтезировать все витамины, за исключением биотина, который должен обязательно содержаться в питательной среде.
В качестве питательной среды при культивировании спиртовых дрожжей использовали модифицированную среду Ридера. Состав среды приведен в таблице 3.1.
Жизнедеятельность микроорганизмов зависит не только от состава питательной среды, но и от условий культивирования и физико-химических параметров питательной среды. К факторам, влияющим на жизнедеятельность дрожжей, относятся температура и активная кислотность среды рН.
Известно, что температура культивирования значительно влияет на обменные процессы в клетках, на интенсивность роста микроорганизмов, т.к. она воздействует на скорость всех клеточных реакций. Для культивирования спиртовых дрожжей в аэробных условиях оптимальной является температура 28-ЗОС [19].
Для контроля температуры в биореакторе с рабочим объемом 0,5 литра использовали лабораторный термометр с ценой деления 0,1 С. Регулирование температуры производилось с помощью термостата. Биореактор с рабочим объемом 1 литр снабжен системой автоматического термостатирования.
Соблюдение оптимальной концентрации водородных ионов является очень важным фактором, обуславливающим нормальный рост и размножение микроорганизмов во время культивирования. Для интенсивного роста и размножения спиртовых дрожжей в аэробных условиях необходимо поддержание рН в диапазоне 4,8-5,0 [19]. При размножении дрожжей на гидролизате происходит повышение кислотности среды, т.к. во время интенсивного размножения дрожжи усваивают азот аммонийных солей, а в среде накапливаются анионы серной кислоты, в результате чего рН среды понижается.
Уровень рН культуральной жидкости контролировался с помощью рН-метра Mini Digi ОР-110. Регулирование рН осуществлялось путем подачи 10% водного раствора аммиака.
