Содержание к диссертации
Введение
1 Мембранные устройства газового питания и методология расчета материально-энергетического баланса микробного роста 9
1.1 Конструкции биореакторов с мембранным устройством газового питания 9
1.2 Теоретические основы массопереноса кислорода через непористые мембраны 11
1.3 Потребность микроорганизмов в кислороде. Сравнительная энергоэффективность аэробного роста и анаэробиоза 23
1.4 Теоретические основы расчета материального баланса микробного роста 28
1.5 Технологические риски в процессах выращивания чистых культур в аэробных условиях 34
1.6 Постановка задачи исследования 38
2 Разработка и технические испытания биореакторов с мембранными устройствами газового питания 40
2.1 Колонные биореакторы с осевым и винтовым движением потока 40
2.2 Технические испытания мембранного устройства 45
2.2.1 Оценка изменения деформации мембраны при многократной стерилизации 46
2.2.2 Оценка провисания трубчатых мембран при максимальном давлении 49
2.2.3 Оценка рабочего объема аппаратов и удельной поверхности мембран 49
2.3 Исследование гидродинамики жидкостного потока 53
2.3.1 Материалы и методы исследования гидродинамики 54
2.3.2 Исследование режима течения потока в биореакторе 57
2.3.3 Выбор типа и идентификация гидродинамической модели биореактора 61
2.4 Оценка параметров массообмена кислорода в биореакторах с мембранными устройствами газового питания 64
2.4.1 Материалы и методы выполнения исследований 64
2.4.2 Оценка массообменных характеристик биореакторов 71
3 Исследование процессов выращивания спиртовых дрожжей в биореакторе с мембранным устройством газового питания 79
3.1 Материалы и методы исследования процессов выращивания инокулята спиртовых дрожжей 79
3.1.1 Характеристика спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae 79
3.1.2 Питательная среда 80
3.1.3 Методы технохимического контроля 81
3.1.4 Технологическая схема и управление процессом выращивания спиртовых дрожжей 85
3.2 Режимы культивирования и микробиологический контроль процесса 93
3.4 Методика расчета стехиометрических параметров роста спиртовых дрожжей в стационарном режиме культивирования 103
3.5 Удельные затраты энергии и доля популяции, обеспеченная кислородом, в стационарном процессе выращивания инокулята спиртовых дрожжей 106
4 Разработка рекомендаций по конструкции промышленного биореактора колонного типа 118
4.1 Проблема масштабирования биореактора 118
4.2 Рекомендации по технологической обвязке инокулятора промышленного масштаба 119
4.3 Разработка технического задания на промышленный образец инокулятора 123
Заключение 126
Список сокращений и условных обозначений 129
Список использованных источников 131
Приложение А
Приложение Б
- Потребность микроорганизмов в кислороде. Сравнительная энергоэффективность аэробного роста и анаэробиоза
- Оценка рабочего объема аппаратов и удельной поверхности мембран
- Режимы культивирования и микробиологический контроль процесса
- Рекомендации по технологической обвязке инокулятора промышленного масштаба
Потребность микроорганизмов в кислороде. Сравнительная энергоэффективность аэробного роста и анаэробиоза
Распределение потоков энергии в живой клетке может быть описано аддитивной функцией затрат на поддержание жизнедеятельности и рост, в соответствии с постулатом Стоутхамера и Пирта [48]. Однако такой подход не позволяет оценить долю энергии, получаемой популяцией по альтернативным путям метаболизма, а также эффективность расхода этой энергии. Поэтому значительный объем исследований был посвящен экспериментальным оценкам эффективности процессов получения энергии за счет различных процессов преобразования молекул субстратов.
При производстве спиртов, пивоварении дрожжи растут без доступа воздуха анаэробно на сахаросодержащих средах. В этих условиях потребляемые сахара превращаются в углекислый газ и ряд органических продуктов брожения, например, спирты.
Брожение протекает без участия кислорода, все окислительно-восстановительные превращения субстрата происходят за счет его преобразования (расщепления) его молекул. При этом высвобождается часть энергии, заключенной в молекуле субстрата, и происходит ее накопление в молекулах АТФ [49]. Однако, при брожении из субстрата извлекается незначительная доля химической энергии. Продукты, образующиеся в процессе брожения, все еще содержат в себе значительное количество энергии, находящейся в исходном субстрате [50].
При брожении некоторые реакции на пути анаэробного преобразования субстрата связаны с наиболее примитивным типом фосфорилирования субстратным фосфорилированием. Например, окисление фосфоглицеринового альдегида (ФГА), катализируемое ФГА-дегидрогеназой, приводит к образованию богатого энергией метаболита -1,3-дифосфоглицериновой кислоты (1,3-ФГК). Анаэробное окисление пировиноградной или а-кетоглутаровой кислот приводит к образованию высокоэнергетических метаболитов - ацетил КоА или сукцинил КоА соответственно.
Богатые энергией соединения, получающиеся в реакциях рассмотренных выше типов, представляют в большинстве случаев ангидриды фосфорной кислоты или тиоэфиры органических кислот. Последние используются для синтеза АТФ через ферментативную стадию образования соответствующих ацилфосфатов [51].
Количество свободной энергии, а также характер образующихся продуктов брожения определяются природой конечных акцепторов электронов. При брожении конечными акцепторами электронов служат в основном органические соединения. Если конечным акцептором электронов является ацетальдегид, образуется этанол, если пируват - молочная кислота.
Восстановленные соединения, акцептировавшие электроны, выделяются из клеток в окружающую среду и накапливаются в ней в значительных количествах, ингибирующих процессы биосинтеза. Из-за низкого энергетического выхода процессов брожения для обеспечения энергией всех функций и биосинтетических процессов клетке приходится перерабатывать значительные количества субстратов в реакциях субстратного фосфорилирования [52].
Процесс спиртового брожения суммарно можно выразить следующим уравнением: СбН,206 + 2ФН + 2АДФ = 2СН3-СН2ОН + 2С02 + 2АТФ + 2Н20 (1.24)
Как видно из уравнения, сбраживание одной молекулы глюкозы приводит к образованию 2 молекул АТФ [53], а в процессе дыхания при полном окислении молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ. При аэробной дрожжегенерации расход сахара снижается за счет большей энергетической эффективности процесса дыхания. При этом потребление сахара в процессе зависит не только от его концентрации в среде, но также от скорости насыщения среды кислородом, от температуры и т.д. Регулируя условия культивирования можно обеспечить соответствующую экономию субстрата [54]. По данным Ю.Э. Швинка приблизительно 90 % потребленного кислорода в аэробном процессе роста дрожжей связано с функциями дыхательной цепи, т.е. продуцированием энергии в клетке бактерий [55].
Независимо от механизма получения энергии (брожение или аэробное окисление) эффективность запасания выделяющейся энергии в макроэнергетических связях АТФ приблизительно одинакова [51].
Но даже при аэрации среды, дрожжи продолжают перерабатывать сахара в углекислый газ и этанол до тех пор, пока концентрация Сахаров не упадет до определенного уровня. Высокий уровень легко усваиваемых Сахаров подавляет способность клеток осуществлять аэробное дыхание, даже когда нет недостатка в кислороде. Это явление носит название катаболитной репрессии [56].
В анаэробных условиях образующийся этанол не подвергается дальнейшим превращениям, тогда как в аэробных условиях дрожжевые клетки после использования запасов сахара начинают утилизировать накопленный ими этанол, переводя его в углекислый газ и воду. Известно, что в аэробных условиях при культивировании в периодическом режиме рост дрожжей после истощения запаса глюкозы останавливается, затем после небольшого лаг-периода возобновляется. В течение этого лаг-периода клетки синтезируют ферменты, необходимые для аэробной утилизации этанола [57]. Поэтому высокий выход дрожжей достигается в условиях эффективной аэрации на среде с низким содержанием сахара [58]. Такие условия легче реализовать в непрерывном процессе, чем в традиционно применяющемся периодическом выращивании посевного материала с дробными добавками субстрата. При отсутствии ингибирования спиртовые дрожжи могут расти в условиях брожения с высокой скоростью, не уступающей процессу аэробного роста [59]. Однако, такой режим может поддерживаться также только в условиях непрерывного культивирования, поскольку в периодическом процессе происходит быстрое накопление этанола до ингибирующих концентраций. Наконец, в условиях свободного доступа кислорода процесс спиртового брожения ингибируется и активизируется дыхание. Это явление получило название «эффекта Пастера» [53]. «Эффект Пастера» есть результат определенного взаимодействия между механизмом регуляции различных метаболических блоков, определяющих наработку энергии. Одним из проявлений такого взаимодействия является конкуренция за АДФ и неорганический фосфат между процессами субстратного фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи [54].
Механизм эффекта Пастера изучен недостаточно. Существует множество гипотез. Согласно «мембранной гипотезе» эффект Пастера объясняется изменениями проницаемости мембран митохондрий, в зависимости от уровня аденозинтрифосфата (АТФ) в клетке. При высоком уровне АТФ в клетке мембраны митохондрий непроницаемы и в цитоплазму клетки не поступают особые «усиливающие факторы», стимулирующие эффекты гликолиза. При низком уровне АТФ проницаемость мембран митохондрии увеличивается и в цитоплазму поступают усиливающие факторы, стимулирующие эффекты гликолиза [58].
Концентрация растворенного кислорода влияет на скорость потребления субстрата микроорганизмами. Известно, что критическая концентрация кислорода для различных микроорганизмов различна. Так, например, для Saccharomyces cerevisiae она составляет 0,6 мг/л [60].
В настоящее время проблема снятия лимита кислорода при выращивании микроорганизмов в промышленных условиях полностью не решена и транспорт кислорода к клетке, а также насыщение им культуральной жидкости существенно влияют на продуктивность процесса [61]. Поэтому при осуществлении процессов дрожжегенерации необходимо управлять аэрацией, перемешиванием и подачей субстрата, т.е. обеспечивать определенные соотношения концентраций компонентов, а также физико-химических параметров культуральной жидкости [62-66].
Оценка рабочего объема аппаратов и удельной поверхности мембран
Осуществлено измерение объема вытесненной из аппарата дистиллированной воды при изменении давления в полостях мембранного блока для обеих конструкций. Объем вытесненной воды равен изменению рабочего объема аппарата от избыточного давления в полости мембранного блока. Соответственно пересчитывается объем и поверхность мембран. Эксперимент проведен при температуре 20 С.
Попытка использования углекислого газа для подпора мембранного блока не дала воспроизводимых результатом, поскольку газ диффундировал через мембрану и растворялся в заметных количествах, изменяя общий объем жидкой фазы. В связи с этим была осуществлена подача технического кислорода, подаваемого из баллона. Эксперимент показал хорошую воспроизводимость. Экспериментальные данные, полученные для аппарата 1-го и 2-го типа, показаны на рисунке 2.10 и рисунке 2.11 соответственно.
Экспериментальные данные для обеих конструкций аппроксимировались полиномиальной функцией третьей степени с использованием табличного процессора «Excel».
Р-избыточное давление в полости мембранного блока, бар.
На основании полученных зависимостей пересчитывается величина площади поверхности мембранного блока для каждого аппарата. Для этого используем следующую формулу.
Основные характеристики обеих конструкций биореакторов, используемые в расчете удельной площади поверхности мембран, приведены в таблице 2.4.
Полученная зависимость удельной площади поверхности мембран для аппарата 1-го типа приведена в таблице 2.5 и рисунке 2.12.
Полученная зависимость удельной площади поверхности мембран для аппарата 2-го типа приведена в таблице 2.6 и рисунке 2.13.
Из приведенных зависимостей (рис. 2.12 и рис. 2.13) видно, что минимальная площадь поверхности мембран составляет 155и 127 м2/м3 для аппаратов 1-го и 2-го типа соответственно.
Режимы культивирования и микробиологический контроль процесса
Поскольку применение любого биореактора в системе выращивания чистой культуры включает пусковой и рабочий режимы, рассмотрение и анализ процесса выращивания дрожжей в аппаратах с мембранными устройствами газового питания начнем с пускового переходного режима.
Первый процесс был проведен на среде Рид ер (табл. 3.1) по двухпоточной схеме с использованием стерильных потоков концентрированной среды и воды. Задача заключалась в сравнении удельных скоростей роста, достигаемых на качалочных колбах и в начальный период пускового процесса, проводимого в биореакторе объемом 1 л, а также оценке реакции культуры на управляющие воздействия (включение, изменение протока).
Как следует из графика (рис. 3.6) после пересева культуры с качалочных колб на ту же самую среду лаг-фазы не наблюдается. После включения протока на 19 час от начала процесса (расход 50 мл/час, входная концентрация 2,23% РВ) культура реагирует немедленно. Процесс практически переводится в стационарный режим 1. Изменение протока на 56 час от начала процесса (расход 62,5 мл/час, входная концентрация 4,5% РВ) переводит процесс в непрерывный режим 2. При этом асептичность процесса сохраняется в течение всего времени биотехнологического испытания. На приведенных фотографиях (рис. 3.7-3.9) показана популяция дрожжевых клеток в поле большого квадрата камеры Горяева при увеличении 900х.
На оптимальных стационарных участках процессов выращивания дрожжей в аппаратах А и Б данные оптического микроскопирования при увеличении 900х представлены на рисунках 3.9 и 3.10 соответственно.
В стационарных режимах, реализованных в исследуемых аппаратах, доля почкующихся клеток составляла 45 - 55%, что свидетельствует о нахождении культуры дрожжей в активном физиологическом состоянии.
Применение модифицированной среды 2 (табл. 3.1) приводит к удвоению стационарной концентрации биомассы (рис. 3.11), против процесса, представленного на рисунке 3.6.
Выведение процесса на рабочую концентрацию инокулята (около 10 гАСБ/л) было предпринято и в эксперименте по культивированию дрожжей в биореакторе 2-го типа (рис. 3.12). При этом использовались модифицированная среда 3 (табл. 3.1) и идентичные среды с повышенной концентрацией глюкозы.
Расчет концентрации биомассы по данным измерения оптической плотности осуществлялся по эмпирической формуле: х = 8,36-(ОП - 0,08), полученной на основе определения концентрации отмытой сухой биомассы весовым методом. Здесь 0,08 - средняя оптическая плотность фильтрата культуральной жидкости.
На первом участке с момента включения подачи подпитки (t=5 ч, РВвх = 8% масс.) до переключения потока (t=26 ч, РВвх = 15% масс.) удельная скорость протока составляла 0,085 ч 1. На втором участке (до t=42 ч.) она практически не варьировалась и в среднем составляла 0,089 ч" . На третьем участке (РВвх = 20%) проток составил 0,096. Очевидно, для использованных сред (без дополнительных ростовых факторов) предельный проток не может превышать 0,1 ч"1. Поскольку производительность биореактора по биомассе определяется двумя факторами - концентрацией биомассы и скоростью протока, для достижения максимально возможной производительности с использованием стандартной среды в непрерывных экспериментах было рекомендовано значение D 0,1 ч 1. При этом концентрация биомассы достигает примерно 10 г АСБ/л. Такая же скорость разбавления применяется в промышленных условиях при ведении процессов выращивания кормовых дрожжей на спиртовой барде и в ряде других процессов.
В проведенном эксперименте были выделены три участка, режимы которых отличались величиной входной концентрации субстрата. Данные по указанным участкам сведены в таблицу 3.2. При этом концентрация субстрата во входном потоке пересчитана с учетом объема поданного титранта.
Как следует из таблицы 3.2, увеличение входной концентрации субстрата выше 15% приводит к падению продуктивности и резкому падению экономического коэффициента вследствие снижения величины соотношения потоков кислорода и субстрата, поскольку энергетическая эффективность гликолиза существенно ниже, чем дыхания. Снижение экономического коэффициента при меньших концентрациях субстрата может быть объяснено эффектом субстратного лимитирования вследствие малой величины протока. Однако, с практической точки зрения интерес представляют процессы с концентрацией субстрата, не превышающей 5-6%, поскольку такие концентрации РВ могут быть получены в процессах гидролиза различных видов дешевого и доступного растительного сырья [119].
Стационарные процессы, реализованные в биореакторах, можно сравнить по параметрам на временных интервалах с близкими значениями биомассы (табл. 3.3).
С целью получения сравнительной оценки рассмотрим процесс массопереноса кислорода через мембрану (рис. 3.13)
Достижение нулевой концентрации растворенного кислорода и даже его концентрации, равной ks, нежелательно, поскольку процесс переводится в режим жесткого лимитирования по кислороду. С другой стороны, высокая концентрация остаточного кислорода свидетельствует о субстратном лимитировании процесса роста популяции микроорганизмов, что приводит к потерям кислорода в связи с его уносом выходящим газовым потоком. Оптимум, очевидно, будет зависеть от состава среды и величины протока.
В случае, когда в стационарных режимах кислород в выходном потоке присутствует, очевидно, что его концентрация и экономический коэффициент процесса будут определяться концентрацией субстрата в культуральной жидкости.
В первом приближении можно считать, что эффективность использования субстрата определяется отношением входного потока субстрата к выходной концентрации кислорода: F = D-(Sex - Sebix)/c. Рассмотрим соотношение основных показателей в стационарных процессах выращивания спиртовых дрожжей в биореакторах 1-го и 2-го типов (табл. 3.4)
Рекомендации по технологической обвязке инокулятора промышленного масштаба
Показано, что последовательное соединение биореакторов вытеснения с мембранными устройствами газового питания и оптимальной организацией подпитки позволяет получать в непрерывном режиме инокулят с концентрацией активных дрожжей до 10 гАСБ/л [120].
Схема обвязки секций инокулятора, соответствующая этому режиму, показана на рисунке 4.1. При этом, в жидкостном потоке на выходе третьей секции кислород отсутствует.
Собственно, рассмотренная схема обвязки, представляет собой один аппарат с промежуточным штуцером подпитки субстратом. При увеличении скорости рециркуляции жидкостного потока необходимость в промежуточном штуцере отпадает, т.к. вводимый субстрат не будет успевать полностью потребляться за один проход жидкости через рабочий объем реактора.
При концентрации биомассы около 7 гАСБ/л наступает лимитирование роста популяции кислородом. До половины популяции клеток оказывается в анаэробных условиях. Нелимитирующее количество кислорода получают только клетки, находящиеся в слое, омывающем мембраны. Тем не менее, рабочая концентрация активных клеток на выходе третьей секции аппарата достигает заданного значения, как было отмечено, 10 гАСБ/л.
Поскольку инокулятор работает в непрерывном режиме, периодически требуется его остановка для стерилизации и подсева новой культуры, и рассмотренная выше схема обвязки не удобна с точки зрения организации таких технологических операций.
В качестве альтернативной рассматривалась схема с параллельным соединением первой и второй секций аппарата (рис. 4.2). При этом секции 1 и 2 работают в непрерывном режиме попеременно. Когда одна секция включена в непрерывный процесс, другая секция работает в периодическом режиме выращивания культуры с очередного засева.
Но наиболее приемлемым оказался третий вариант обвязки с параллельным соединением всех трех секций. После первоначального выращивания посевного материала в трех секциях, культуральная жидкость из двух секций выгружается в дрожжегенератор. А затем производится розлив культуры из третьей секции по двум первым (рис. 4.3).
После пускового периода вся система переводится в непрерывный режим работы и подпитывает дрожжегенератор свежей культурой в течение 4 суток (рис. 4.4).
Затем процесс повторяется. При этом первоначально секции загружаются по очереди. И так же они могут выводиться на режим стерилизации. В эксплуатационном отношении такой вариант более предпочтителен, поскольку снижается «чувствительность» всей системы к возможным отказам и сбоям (без больших проблем в любой момент может быть отключена любая секция).
Последующее выращивание чистой культуры дрожжей предлагается осуществлять в аэробных условиях в аппарате с перемешиванием [7, 10, 23, 121, 122].
Схема установки по производству чистой культуры спиртовых дрожжей, включающая инокулятор Р1 (условно показана одна из параллельных секций) представлена на рисунке 4.5.
В качестве аппарата второй ступени предлагается использовать секционированный биореактор [121] с механическим устройством перемешивания и магнитным приводом, оснащенный пористым фильтром стерилизации воздуха, выполненным с использованием металлопорошковой технологии [123]. Секционированность биореактора Р2 обеспечивает запуск аппарата в режиме постоянного подсева с минимизацией энергозатрат (нижняя секция имеет меньший диаметр) и поддержанием в течение всего процесса достаточно высокой концентрации биомассы, блокирующей в определенной степени развитие посторонней микрофлоры в случае ее проникновения в биореактор.
