Введение к работе
Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной биотехнологии является разработка новых подходов для детекции бактерий с помощью бактериофагов (Schofield, Sharp, Westwater, 2012; Smartt et al., 2012; Wang, Ye, Ying, 2012). Этому вопросу посвящено сравнительно большое количество научных статей, однако, развитию методов детекции почвенных микроорганизмов, уделяется недостаточное внимание, хотя роль этих микроорганизмов весьма значительна как для развития фундаментальных исследований, так и для современной сельскохозяйственной биотехнологии.
Важную роль в процессах азотфиксации играют грамотрицательные рост-стимулирующие бактерии рода Azospirillum. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав…» (Dbereiner, Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan, Holguin, de-Bashan, 2004). Среди азоспирилл наибольшее внимание исследователей привлекает вид Azospirillum brasilense как модельный объект при изучении ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan, Holguin, de-Bashan, 2004; Мулюкин и др., 2009). Эти ризобактерии могут способствовать развитию растений как непосредственно (азотфиксация, гормональный эффект, улучшение минерального и водного питания растений), так и опосредованно, путем подавления развития бактериальных патогенов. В последнее время азоспириллы рассматриваются как перспективный компонент консорциума ризобактерий для инокуляции в качестве компонентов бактериальных удобрений (Чернова, Бурыгин, 2008).
Прогресс в исследовании азоспирилл в качестве экологически безопасных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов определения данных микроорганизмов в почве. Кроме того, значительный интерес при исследовании собственно феномена ассоциативной микрофлоры представляет изучение их сезонных колебаний, а также изменения их численности, вызванные антропогенными воздействиями. В целом, развитие подходов, позволяющих осуществлять мониторинг состава ризосферных бактерий, представляется одной из актуальных задач современной экологической микробиологии (Красов, 2009).
Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распространенную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов (Фильчиков и др., 2009). Бактериофаги широко распространены в природе и выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем» (Шестаков, 2007), они представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Несмотря на то, что история изучения и использования бактериофагов имеет много десятилетий, бактериофаги почвенных микроорганизмов изучены мало, хотя их роль в контроле численности бактерий и способствовании переносу генов весьма значительна (Boyer et al., 2008).
Перспективным направлением дальнейших исследований по изучению ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями, является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов, в том числе бактериофагов Azospirillum brasilense, а также разработка новых методов индикации почвенных бактерий с помощью бактериофагов.
Цель работы – выделение и изучение бактериофагов из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75, и их применение для детекции бактерий рода Azospirillum с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.
Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:
-
Выделить бактериофаги из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 и изучить их биологические свойства.
-
Исследовать изменения электрооптических параметров микробных суспензий различных штаммов A. brasilense при их инфицировании бактериофагами из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75.
-
Изучить возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения спектра литического действия бактериофагов на примере бактерий рода Azospirillum.
-
Использовать метод электроакустического анализа клеточных суспензий для детекции клеток Azospirillum при их инфицировании специфическими бактериофагами.
-
Исследовать возможность применения миниантител, специфичных к липополисахариду и флагеллину A. brasilense Sp245, для детекции бактерий с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.
Научная новизна работы.
Из микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с использованием индуцирующего фактора – низкой температуры выделены бактериофаги
Ab-Sp7 и Ab-SR75. У клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 обнаружено явление лизогении. Представлена характеристика выделенных бактериофагов и определено их таксономическое положение, они относятся к семейству Podoviridae.
Впервые выделенные бактериофаги были использованы для детекции бактериальных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий. На примере микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 показано, что с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий возможно определение спектра литической активности и специфичности действия бактериофагов.
Впервые применены миниантитела для детекции бактерий A. brasilense Sp245 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий. Установлено, что взаимодействие миниантител с бактериальными клетками A. brasilense Sp245 приводит к изменению электрооптических параметров микробной суспензии и изменению величины значения электрического импеданса.
Практическая значимость работы.
Выделение и изучение бактериофагов из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 открывает перспективы для их использования при разработке высокочувствительных и ускоренных методов детекции гомологичных бактериофагам бактерий.
Материалы, представленные в диссертации, используются при чтении лекций по биотехнологии и микробиологии для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.И. Вавилова» и ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
У микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 выявлено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора – низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75.
-
Изменения электрооптических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами позволяют определять литическую активность бактериофагов.
-
Изменения электрооптических и электроакустических свойств микробных суспензий азоспирилл при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции клеток азоспирилл.
-
Методы электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий позволяют проводить детекцию бактерий с применением миниантител.
Апробация работы.
Основные положения работы были представлены на: 13-ой, 14-ой и 16-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009; 2010; 2012); 5-ой и 6-ой Всероссийских конференциях молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010; 2012);
6-ой и 8-ой Молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010; 2012);
III Региональной научной конференции «Исследование молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); 6-ом Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); European Congress of clinical microbiology and infectious disease (London, 2012); IV Съезде биофизиков России. Симпозиуме IV «Новые тенденции и методы в биофизике» (Нижний Новгород, 2012); Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012).
Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 2009-2012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В).
Работа поддержана грантами РФФИ №09-02-12442-офи_м, президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых – докторов наук МД-57.2008.4 (2008-2009 гг.), а также Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 05 октября 2009 г. и Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 29 июня 2010 г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, состоящего из 215 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 173 страницах компьютерного текста, включающего 36 рисунков и 13 таблиц.
