Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярная архитектура клеточной стенки гра-мотрицательных бактерий достаточно хорошо изучена на примере семейства Enterobacteriaceae. В тоже время, разнообразие грамотрицательных микроорганизмов не исчерпывается представителями этого семейства. Очевидно, что экстраполяция представлений о клеточной стенке семейства энтеробактерий на всю группу грамотрицательных прокариот не вполне правомерна. Основанием для этого, в частности, служат результаты, полученные при изучении клеточной поверхности почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum. К числу таких результатов можно отнести способность азоспирилл к образованию на клетке полярного пучка пилей (Шелудько и Кацы, 2001); наличие углеводных фрагментов в составе полярного жгутика (Moens et al, 1995); обнаружение липополиса-харид-белковых и полисахарид-липидных комплексов в составе капсульного материала (Коннова с соавт., 1994); отсутствие индивидуального капсульного антигена (Матора и Щеголев, 2002); установленный для азоспирилл характер R-S диссоциации, нетипичный для грамотрицательных микроорганизмов (Серебренникова, 1998) и др. Таким образом, азоспирилла, являясь, безусловно, типичным представителем грамотрицательных бактерий, демонстрирует особенности строения своей наружной мембраны. В первую очередь, это относится к структуре основных антигенов - соматического, жгутикового и капсульного. Изучение деталей строения этих важнейших бактериальных антигенов представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность узнать, как организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы при создании биоспецифических зондов для экологических и таксономических исследований азоспирилл.
Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении жгутикового и соматического антигенов азоспирилл типовых штаммов и изучение топографической диспозиции этих антигенов в составе клеточной поверхности бактерий. В соответствии с этой целью, в данной работе были сформулированы следующие задачи:
Исследовать природу ранее обнаруженных антигенных перекрестов для препаратов полярного жгутика с препаратами липополисахарида (ЛПС) бактерий рода Azospirillum.
Получить ответ на вопрос, являются ли углеводные фрагменты гликозилиро-ванного флагеллина полярного жгутика азоспирилл специфическими антигенами, или они иммунохимически идентичны соматическому антигену.
Провести сравнение иммунохимических, электрофоретических и спектро-фотометрических характеристик ЛПС штаммов азоспирилл, принадлежащих к одному и тому же и к разным серотипам.
Оценить иммунохимическую специфичность углеводных антигенов типового штамма A. brasilense Sp245 на основе конкурентного иммуноанализа с применением современных вариантов методов спектротурбидиметрии и динами-
ческого рассеяния света.
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА |
^b^isi
С.Пет«рбу
оэ wef
5. Проанализировать изменения липополисахаридных антигенов в зависимости
от возраста и условий выращивания бактериальной культуры.
Научная новизна работы. Выявлено наличие чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика бактерий p. Azospirillum.
Продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов A. brasilense и A. lipoferum.
Показано, что углеводные структуры, входящие в состав гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма A. brasilense Sp7, антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.
Установлено, что структура антигенных детерминант О-специфических полисахаридов (О-ПС) ЛПС азоспирилл меняется под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах. При этом экспонированность самих О-ПС в составе соматического антигена варьирует в зависимости от фазы роста бактериальной культуры.
Практическая значимость. Предложенный оригинальный способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих хорошее разделение при электорофорезе в ПААГ, может быть использован при решении широкого круга исследовательских и практических задач. Использованный в работе тест на ингибирование подвижности бактерий p. Azospirillum при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител (Ат) на ЛПС может быть применён для их быстрой штаммовой идентификации.
Полученные в работе результаты использованы при проведении совместных исследований с сотрудниками группы генетики микроорганизмов Лаборатории генетики, группы биоорганической химии Лаборатории биохимии и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур ИБФРМ РАН по темам НИР перечисленных научных подразделений. Они отражены также в методическом пособии «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.) и использованы при проведении занятий по спецкурсам «Микробиология с основами вирусологии» и «Физико-химические методы исследования биополимеров» со студентами химического факультета Саратовского госуниверситета. Кроме того, результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Полярный жгутик бактерий рода Azospirillum имеет чехол (ли-по)полисахаридной природы, ассоциированный с поверхностью флагеллы и обладающий экранирующим эффектом.
Н-антиген демонстрирует наличие антигенных перекрестов у представителей видов A. brasilense и A. lipoferum. Углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма A. brasilense Sp7 антигенно идентичны фрагментам соматического антигена.
Спектры поглощения света препаратами ЛПС имеют характерные отличия для серологически различных штаммов, а изменения спектров, наблюдаемые
внутри одного серотипа, коррелируют с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.
Иммунодоминантным моносахаридом в составе антигенных детерминант липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) штамма A. brasilense Sp245 является галактоза.
Антигенные свойства ЛПС азоспирилл зависят от фазы роста культуры и условий культивирования бактерий на лабораторных средах.
Обработка протеиназой К высокомолекулярного ЛПС-содержащего комплекса, экстрагированного из наружной мембраны азоспирилл, обеспечивает получение высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих эффективное разделение при электорофорезе в ПААГ.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на: 6-ой Европейской конференции по азотфиксации (Севилья, Испания, 2000), Межвузовской конференции молодых учёных «Растение, микроорганизмы и среда» (Санкт-Петербург, Россия 2000), Конференции «Молодые учбные Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, Россия, 2001), 2-ой Всероссийской школе по экологической генетике «Симбиогенетика и эволюция» (Санкт-Петербург, Россия, 2001), 1-ой Региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2002), 6-ой Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино-на-Оке, Россия, 2002), 10-ом Международном Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002), 11-ом Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям растений и микроорганизмов (Санкт-Петербург, Россия, 2003) и Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений в условиях техногенных загрязнений» (Саратов, Россия, 2003).
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 24 сентября 2003 года.
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных работах, включая 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных источников, содержащего 187 источников, и двух приложений. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 2 таблицы.
