Введение к работе
Актуальность темы. Представители рода Azospirillum относятся к ассоциативным азотфиксаторам. Они, как правило, ассоциированы с различными почвами, с корневой системой диких травянистых растений, кормовых трав, злаков (Игнатов, 1998), за исключением A. largimobile, обитающего в водных биотопах (Dekhil et ah, 1997; Sly, Stackebrandt, 1999). Azospirillum могут быть полезны в технологии выращивания сельскохозяйственных культур, а также в качестве модельного объекта для изучения ассоциативных отношений между растениями и микроорганизмами.
Преимущественно представители рода Azospirillum имеют органогетеротрофный тип метаболизма, хотя известно, что некоторые штаммы A. lipoferum способны к водород - зависимому автотрофному росту, что не исключает способности к литотрофии у других видов этого рода в присутствии Н2, восстановленных соединений серы и др.
На момент написания диссертации род Azospirillum представлен пятнадцатью видами, и данные о видовом составе рода с каждым годом пополняются. Так за последние 5 лет описано 8 новых видов. В последние годы было показано, что представители рода Azospirillum (Del Gallo, 1994J имеют различное географическое происхождение и способны занимать разнообразные экологические ниши. Существование Azospirillum в различных климатических поясах, сложных гетерогенных условиях почвы, смена мест обитания (почва - ризосфера - растение) требуют от бактерий высокой приспособляемости к постоянно меняющимся условиям обитания, гибкости метаболизма.
Изучение биоразнообразия представителей рода Azospirillum и изучение множественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию бактерий в неравновесных условиях среды, имеет важное значение, так как позволяет понять причину господствующего положения бактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах углерода, азота и т.д.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлось изучение фенотипических и генетических характеристик нового представителя рода Azospirillum, определение его таксономической принадлежности и изучение особенностей углеродного и серного метаболизма.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Из умеренно термального сероводородного источника выделить чистую культуру нового представителя азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum.
Определить филогенетическое и таксономическое положение нового штамма BV-ST.
Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы в метаболизме и механизм их окисления: определить активность ферментов,
участвующих в процессах превращения соединений серы, проверить наличие ряда генов, кодирующих ферменты серного метаболизма, и определить уровень их экспрессии в аэробных и микроаэробных условиях.
Установить связь окисления восстановленных соединений серы с функционированием ЭТЦ.
Выделить и получить высокоочищенный препарат МДГ из исследуемых бактерий, изучить структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у Azospirillum thiophilum в зависимости от типа питания.
Научная новизна и значимость работы. Используя современные методы полифазной таксономии, изучено филогенетическое и таксономическое положение нового представителя рода Azospirillum. Анализ последовательности 16S рРНК позволил отнести выделенный штамм к Alphaproteobacteria, который был охарактеризован как новый вид азотфиксирующих бактерий, Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp.nov. BV-S . Впервые для представителей рода Azospirillum, в частности для A. thiophilum sp.nov., в микроаэробных условиях показана способность к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы. Показано, что в присутствии тиосульфата переход от органотрофного роста к литотрофному возможен только в микроаэробных условиях культивирования.
В ходе проведенной работы удалось показать структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у Azospirillum thiophilum в зависимости от типа питания. МДГ, полученная из A. thiophilum при органотрофном и литотрофном росте, представлена как димером, участвующим в работе ЦТК, так и тетрамером, функционирующим в глиоксилатном цикле. При органотрофном росте доминирующей формой является димер, поддерживающий энергетический метаболизм, а при литотрофном - тетрамер, поддерживающий конструктивный метаболизм. Поскольку у Azospirillum thiophilum при литотрофном росте снижается доля димерной формы МДГ, участвующей в энергетическом метаболизме, то можно предположить, что значительная часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окисления восстановленных соединений серы.
Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биоразнообразии бактерий. Изучение множественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию бактерий в неравновесных условиях среды, имеет большое значение, так как позволяет выяснить функциональную роль окисления соединений серы и понять причину господствующего положения бактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах азота, углерода, серы.
Практическая значимость работы. Результаты исследований расширяют фундаментальные представления о разнообразии бактерий и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в природных сообществах. Полученные в
работе результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебных пособий по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии.
Полученные высокоочищенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, а также как ферментные препараты в качестве модельного образца для других методов исследования. Прикладные аспекты изучения сероокисляющих азотфиксаторов - Azospirillum thiophilum определяются возможностью их использования в районах, обедненных азотом, но обогащенных сероводородом, таких как рисовые плантации и т. д.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на международных и российских конференциях:
Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009).
Международной молодежной школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009).
Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011).
Международной молодежной школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011).
Публикации. Материалы диссертации содержатся в 9 печатных работах: 5 экспериментальных статьях и 4 публикациях материалов конференций. Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 132 страницах, включает 15 таблиц, 22 рисунка, а также 1 страницу приложения, список литературы из 207 наименований, из них 84 на русском и 123 на английском языке.
Место проведения работы. Работа проведена на кафедре биохимии и физиологии клетки биолого-почвенного факультета ФГБОУВПО Воронежского государственного университета при участии студентов, аспирантов. Ряд работ выполнены совместно с к.б.н. Лысенко A.M. (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН), д.б.н. Осиповым Г.А. (академическая группа Академика РАМН Ю.Ф.Исакова).
Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам и друзьям, принимавшим участие на разных этапах работы.
Работа была выполнена при финансировании в рамках грантов РФФИ № 05-04-48229а, № 06-04-63105к, № 09 - 04 - 00799а, № 09 - 04 - 10072к.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., проф. Грабович М.Ю. за содействие в работе и помощь при обсуждении результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
На основе полифазного анализа изолят из сульфидного источника отнесен к неассоциативному виду рода Azospirillum - A. thiophilum sp.nov.
Azospirillum thiophilum sp. nov. в микроаэробных условиях культивирования способен к литотрофному росту в присутствии тиосульфата.
A. thiophilum при литотрофном росте окисляет тиосульфат при участии 2-ух ферментных систем: тиосульфатдегидрогеназы и тиосульфатокисляющего ферментного SOX комплекса.
В зависимости от типа питания в клетке A. thiophilum происходят адаптационные структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы.
