Введение к работе
Актуальность проблемы. Засоление почв является одним из неблагоприятных факторов внешней среды, который в настоящее время значительно лимитирует производство сельскохозяйственной продукции в южных регионах и на орошаемых угодьях (FAO 2008, ). Современная стратегия получения солеустойчивых растений базируется на знании молекулярно-биологических и биохимических механизмов, участвующих в формировании устойчивости. Способность растений выживать в условиях высоких концентраций NaCl связана с имеющимися у них возможностями транспортировки, компартментации, выделения и мобилизации ионов Na+ [Apse & Blumwald 2007]. Среди большого набора ионных транспортеров и каналов, опосредующих эти процессы, важная роль принадлежит Na+/H+-антипортерам плазмалеммы и тонопласта. Эти белки удаляют ионы натрия из цитозоля в апопласт либо компартментируют их в вакуоль в обмен на протоны, используя протонный градиент, генерируемый H+- насосами плазмалеммы и тонопласта [Niu et al. 1995]. Имеются данные о том, что сверхэкспрессия генов вакуолярных Na+/H+- антипортеров приводит к значительному повышению солеустойчивости как растений Arabidopsis thaliana, так и целого ряда культурных растений [Munns & Tester 2008]. Вакуолярные Na+/H+- антипортеры представлены мультигенным семейством родственных изоформ (NHXs), имеющих сходную двухдоменную структуру, но различающихся, по-видимому, спецификой регуляции экспрессии, транспортной активности и ионной селективности, а также локализацией [Rodriguez-Rosales et al. 2009]. Особенности экспрессии и функции отдельных NHX-изоформ недостаточно исследованы.
Цель данной работы заключалась в идентификации кДНК гена Na+/H+-антипортера в ячмене, изучении локализации и особенностей транспортной активности продукта гена, в определении взаимосвязи между изменением экспрессии гена при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя, а также в оценке возможности использования гена для повышения солеустойчивости растений.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Определить нуклеотидную последовательность кДНК изоформы Na+/H+- антипортера в ячмене;
Исследовать внутриклеточную локализацию Na+/H+-антипортера и локализацию в различных органах и тканях;
Показать транспортную активность данной изоформы и оценить ее вклад в общий Na+/H+-обмен на тонопласте;
Установить особенности регуляции экспрессии идентифицированной изоформы Na+/H+-антипортера при солевом стрессе в контрастных по солеустойчивости сортах ячменя;
Экспрессировать полученный ген в модельном растении Arabidopsis thaliana и оценить солеустойчивость трансгенных растений.
Научная новизна. В данной работе была идентифицирована нуклеотидная последовательность, кодирующая новую изоформу вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя HvNHX2 (ГенБанк, Acc.No. AY247791). Показано, что данная изоформа вносит значительный вклад в общий Na+/H+-обмен на тонопласте клеток ячменя. Показано, что экспрессия HvNHX2 в условиях солевого стресса характеризуется органо- и сортоспецифичностью и регулируeтся на пост-транскрипционном уровне. Впервые обнаружена взаимосвязь между увеличением количества белка HvNHX2 при солевом стрессе и сортовой устойчивостью ячменя к засолению. Обоснована возможность использования гена HvNHX2 для получения трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к солевому стрессу.
Апробация работы. Копии кДНК идентифицированного нами гена HvNHX2 были переданы в Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина (Алматы, Казахстан) и в Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия) для проведения работы по трансформации растений табака (Nicotiana tabacum L.) и картофеля (Solanum tuberosum L.) соответственно. В результате было продемонстрировано значительное повышение солеустойчивости трансгенных растений табака [Низкородова и др. 2009] и картофеля [Баят и др. 2010], несущих ген HvNHX2 вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя. Полученные данные подтверждают практическую значимость наших результатов, т.к. свидетельствуют о способности гена HvNHX2 улучшать солеустойчивость некоторых видов культурных растений.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 201 источник. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 30 рисунков.
