Введение к работе
Актуальность проблемы. Абиотические стрессовые воздействия, такие как повышенные и пониженные температуры, засуха, засоление почв, отрицательные температуры, тяжелые металлы и т.п. являются основными факторами, способными снижать урожайность культурных растений на 70% (). При этом, высокая степень засоления почв и длительная засуха обладают самыми пагубными последствиями, приводя к жесткому дефициту влаги ( ). На сегодняшний день, немалая доля пахотных земель находится в зонах, подверженных данным стрессовым воздействиям ().
Изучение механизмов передачи стрессорного сигнала имеет важнейшее фундаментальное значение для понимания процесса адаптации растительных клеток к стрессовым факторам. В зависимости от типа и характера стрессового воздействия, растения и отдельные их клетки используют различные механизмы передачи сигнала, приводящие, в конечном итоге, к изменению экспрессии сотен генов ( ; ). Одним из основных механизмов, определяющим физиологический ответ растительной клетки на осмотический стресс является передача сигнала, регулируемого фитогормоном абсцизовой кислоты (АБК). Несмотря на то, что АБК влияет на множество физиологических и биохимических процессов в растениях, основной ее функцией является регуляция водного баланса растения и адаптация к осмотическому стрессу ( ; ; ; ). В условиях солевого стресса АБК запускает в клетках каскады реакций, приводящие к изменению экспрессии многих генов ( ; ; ). Несмотря на достигнутые успехи в понимании механизмов передачи АБК-зависимого стрессорного сигнала, целый ряд пробелов в отдельных стадиях прохождения сигнала по-прежнему ожидает заполнения. В частности, не в полной мере изучены механизмы регуляции активности белков ABF (ABRE Binding Factor), ключевых факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов в рамках АБК-зависимого пути передачи стрессорного сигнала. Так, например, недавно был установлен факт взаимодействия факторов транскрипции ABF ячменя с регуляторными белками 14-3-3. Однако, какова физиологическая роль такового взаимодействия для белков ABF и для процессов адаптации в целом, не вполне ясно. Принимая во внимание разнообразие изоформ 14-3-3 в различных растениях, встает вопрос о возможной специфичности их взаимодействий с факторами транскрипции ABF или же, наоборот, о том, какую роль может играть возможное многообразие вариантов взаимодействия белков 14-3-3 и ABF. Более того, остается неясным, какую роль для сигнальной трансдукции может играть многообразие изоформ 14-3-3 в разных видах растений. Слабая изученность данной области сигнальной трансдукции, а также важность понимания фундаментальных основ передачи стрессовых сигналов послужила причиной нашего интереса к изучению возможных механизмов взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF.
В качестве объекта исследований было использовано растение Thellungiella salsuginea, близкородственное Arabidopsis, но проявляющее большую устойчивость к таким факторам абиотического стресса, как высокие концентрации солей в почве и воздействие пониженных температур. Данное растение было принято научной общественностью в качестве нового модельного объекта для изучения механизмов устойчивости к абиотическому стрессу.
Перед выполнением работы была сформулирована следующая цель:
- выяснить, возможна ли посттрансляционная регуляция активности факторов транскрипции ABF на основе их взаимодействия с регуляторными белками 14-3-3, а также выяснить, есть ли какие либо отличительные особенности в структуре данных белков и экспрессии кодирующих их генов в растениях Thellungiella salsuginea.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- идентифицировать в Thellungiella salsuginea гены факторов транскрипции ABF;
- охарактеризовать первичную структуру белков ABF из растений Thellungiella;
- охарактеризовать особенности экспрессии генов ABF из Thellungiella под влиянием высоких концентраций солей в питательной среде;
- идентифицировать гены, кодирующие разные изоформы белков 14-3-3 в растениях Thellungiella, и охарактеризовать их первичную структуру;
- охарактеризовать особенности экспрессии генов 14-3-3 в Thellungiella в нормальных условиях и в ответ на стрессовые воздействия;
- выяснить, возможно ли взаимодействие регуляторных белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF и если таковое взаимодействие имеет место, установить, какой мотив в аминокислотной последовательности белков ABF является сайтом связывания белками 14-3-3;
- охарактеризовать степень специфичности взаимодействий регуляторных белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF в Thellungiella.
Научная новизна. В данной работе впервые идентифицированы 4 гена, кодирующих факторы транскрипции ABF в растениях Thellungiella salsuginea. Также, впервые идентифицированы 9 генов, кодирующих разные изоформы регуляторных белков 14-3-3. Установлены полные последовательности кДНК идентифицированных генов. Выявлено, что экспрессия большинства из исследуемых генов возрастает в ответ на действие повышенных концентраций солей. Также обнаружено, что возрастание экспрессии генов, чья функция, по-видимому, связана с адаптацией растения к стрессовым воздействиям, происходит значительно быстрее в растениях Thellungiella в сравнении с модельным объектом Arabidopsis thaliana. Установлено, что большинство изоформ 14-3-3 взаимодействует с факторами транскрипции ABF, при этом такое взаимодействие носит специфичный характер. Выявлено, что мотив RRTLT/SGP белков ABF является критическим для данного взаимодействия.
Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII и X молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2010), VI международном съезде общества физиологов растений России (2007), международном симпозиуме «Plant Abiotic Stress Tolerance» (2009), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 209 источников. Материалы диссертации изложены на 112 страницах машинописного текста, включая 8 таблиц и 30 рисунков.
