Введение к работе
Актуальность темы. В основе научного прогресса лежит эволюция методических приемов, используемых для решения современных задач иммунологии. Внедрение новой методологии, совершенствование методов исследования – главный фактор повышения уровня знаний в области молекулярной биологии иммунного ответа, где ключевую роль играют антитела, рецепторы иммунокомпетнтных клеток, межклеточные взаимодействия. Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной кооперации трех основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008). Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами (МкА), были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation – символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000, Рабсон А. и др., 2006, Бурместер Г.-Р. И др., 2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микро- организмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин А.А., 1999, Давтян Т.К. и др., 2005, Сидорова Е.Б., 2006 и др.). Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:
- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;
- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.
Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR – антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы (Кирюхин А.В. и др., 2003, Добротина Н.А. и др., 2005, Артюхов В.Г и др., 2006 и др.).
Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их биологических свойств, а именно функциональных и рецепторных, в процессах онто- и иммуногенеза является перспективным направлением для определения иммунологической эффективности биологических препаратов, создания новых безопасных вакцин – основу специфической профилактики болезней животных.
В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Haines D.M. и West K.H., 2005, Саидов М.З. и др., 2006, Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.
Цель работы – разработка современной методологии идентификации белков суперсемейства иммуноглобулинов и характеристика их биологических свойств в процессе фило-., онто- и иммуногенеза.
Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:
1. Разработать способы получения иммуноглобулинов изотипов G, М, А (IgG, IgM, IgA) рогатого скота.
2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, А в биологических жидкостях организма рогатого скота и провести сравнительный анализ с моноклональными антителами к Ig.
3. Усовершенствовать методы изучения и оценки растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов
4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к IgM.
5. Изучить протективные свойства белков суперсемейства иммуноглобулинов у мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.
6. Дать характеристику секретируемым и мембранным (sIg) формам Ig крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза.
7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.
Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»; задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».
Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.
Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.
На основании результатов проведенных исследований:
- получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота (Авторское свидетельство № 1560549 от 3.01.90 г. в соавторстве);
- разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2277421 от 5 апреля 2005 г. в соавторстве);
- разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2288008 от 27 ноября 2006 г. в соавторстве);
- разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение № 2293330 от 10 февраля 2007 г.).
Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида.
Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.
Впервые для определения состояния иммунной системы животных выбран критерий взаимосвязи растворимых и мембранных форм иммуноглобулинов.
Практическая значимость. Систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.
Разработаны в соавторстве и утверждены в установленном порядке:
- «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ № 9388-0039-00008064-96, 1996 г.;
- временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии № 13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;
- методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.;
- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина G в биологических жидкостях рогатого скота, 2010 г.;
- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота, 2010 г.
Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:
- методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол № 1) (авторы: Ю.Н.Федоров и И.Ю.Ездакова);
- методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);
- методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);
- методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.04.2010 г. протокол№2) (авторы: И.Ю.Ездакова и Т.А.Чеботарева)
Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 г. и в 2008 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных; «Звезда И.И.Мечникова» за инновационное развитие и продвижение научного наследия И.И.Мечникова в 2010 г.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены:
- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008); Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Гдыня, 2006; Сан-Себастьян, 2007; Эгмонд, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 15 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных», 1 авторское свидетельство и 3 патента на изобретение.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову, д.б.н., профессору О.А.Верховскому, к.б.н. Т.А Чеботаревой и сотрудникам лаборатории иммунологии ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 313 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.
