Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразованиям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу. Недостаточная эффективность и избирательность существующих методов лечения рака делают крайне актуальной проблему поиска новых, более действенных и высокоспецифичных методов диагностики и противоопухолевой терапии. Разработка и исследование комбинаций лекарственных средств, принадлежащих к различным классам и действующих на разные клеточные мишени, представляются перспективными в успешном лечении онкологических заболеваний.
В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием иммунотерапии [Romero P. et al., 2002], которая подразумевает разработку стратегий для разрушения опухолей путем проявления противоопухолевого иммунитета. Так, успешно развивается цитокиновая терапия, специфическая иммунотерапия (вакцинация), адаптивная иммунотерапия (использование опухолеспецифических Т-клеток или моноклональных антител), используется ряд антигенных систем, широко исследуются методы стимуляции гуморального и/или клеточного иммунных ответов, тестируются различные адъюванты. Показано, что белки теплового шока (HSPs) играют важную роль в иммунном ответе, что дало основание использовать некоторые HSPs в качестве вакцин в иммунотерапии рака [Srivastava Р.К., 1998]. Иммунологическое функционирование HSPs, которое получило наиболее пристальное внимание, основано на их способности перемещать антигены (в том числе опухолеспецифические) к антиген-презентирующим клеткам (АПК). Также обнаружено, что взаимодействие HSP-АПК независимо от переносимых антигенов приводит к увеличению количества костимуляторных молекул на антиген-презентирующих клетках и секреции воспалительных цитокинов, а взаимодействие HSPs с некоторыми
В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие зав. кафедрой биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова, академик РАМН, д.х.н., профессор Швец В.И. Активное участие в работе и руководстве диссертацией осуществляла к.б.н. Гороховец Н.В.
рецепторами вызывает активацию дендритных клеток (ДК) и трансдукционных сигналов [Wallin R. et al., 2002]. Эти уникальные иммуностимулирующие свойства HSPs позволяют использовать их в качестве адъювантов для разработки иммунотерапевтических средств.
Альтернативным подходом в решении указанной проблемы является поиск и изучение новых универсальных опухолевых маркеров, которые могли бы стать основой для создания чувствительных диагностических исследований и мишенью для разработки новых способов направленной противоопухолевой терапии. Предпочтением для выбора можно считать опухолеспецифические антигены, которые должны быть белками-рецепторами, избирательно или преимущественно представленными на опухолевых клетках. Известно, что эукариотические клетки путем эндоцитоза могут захватывать вместе с белковым вектором действующие агенты высокой эффективности и специфичности, в других условиях лишенные возможности проникать в клетку. Мишенью для направленного транспорта могут быть рецепторы онкофетальных белков (в частности, рецепторы альфа-фетопротеина [Мого R. et al., 1993]), а в качестве вектора могут выступать сами онкофетальные белки (например, альфа-фетопротеин или его фрагменты). Этот путь направленной доставки предполагает включение механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза (receptor-mediated endocytosis, RME). Создание конъюгатов цитотоксических агентов и различных векторных молекул имеет большие перспективы. С помощью различных кросс-сшивающих агентов образуются ковалентные связи между молекулами белкового вектора и терапевтически активными агентами, например, цитотоксическими препаратами, применяемыми в химиотерапии. Использование механизма RME для доставки в опухолевую клетку конъюгированного цитотоксического препарата позволяет помимо задачи повышения эффективности цитотоксического действия решить проблему селективности и преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.
Цели и задачи работы. Целью работы явилось создание и изучение потенциала в противоопухолевой терапии рекомбинантного белка теплового
шока HSP70A1B человека и рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D). В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
клонирование и экспрессия в E.coli генных конструкций, осуществляющих биосинтез белка теплового шока HSP70A1B человека и третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D);
разработка технологического метода получения рекомбинантных белков HSP70A1B и AFP3D;
исследование биологической активности рекомбинантного HSP70A1B по способности взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками;
сравнение биологической активности рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D с активностью природного альфа-фетопротеина человека;
синтез цитотоксического конъюгата AFP3D с химиопрепаратом, обеспечивающего направленное воздействие на опухолевые клетки, и исследование его эффективности in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК E.coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез белка теплового шока человека HSP70A1B и третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D в клетках соответствующих штаммов-продуцентов.
Разработаны высокоэффективные методы выделения исследуемых рекомбинантных белков в препаративном количестве.
Исследована биологическая активность рекомбинантного HSP70A1B, а также показана его способность к связыванию и активному эндоцитозу дендритными клетками.
Продемонстрирована возможность использования рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека в качестве векторной молекулы для создания противоопухолевых препаратов направленного действия за счет сохранения в AFP3D функциональной активности полноразмерной молекулы природного альфа-фетопротеина человека.
Синтезирован ковалентный конъюгат рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека с таксолом, и показана высокоспецифическая цитотоксическая активность конъюгата in vitro по отношению к клеткам злокачественной опухоли.
Полученные штаммы-продуценты HSP70A1B и AFP3D человека и разработанные методы их выделения могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а соответствующие рекомбинантные белки - в научно-исследовательских работах с последующим потенциальным применением в области практической медицины.
В целом, данная работа демонстрирует роль, которую рекомбинантные белки человека HSP70A1B и AFP3D могут сыграть в противоопухолевой терапии в качестве иммуномодулятора и вектора для направленной доставки лекарственных средств соответственно, а также подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования систем различного механизма действия с использованием рекомбинантных белков.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Greece, Rhodes, 2005); 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (Budapest, Hungary, 2006); Российский Медицинский Форум «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology" (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007).
По материалам диссертации опубликовано 5 работ, оформлена 1 заявка на выдачу патента РФ на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах; содержит рисунков и таблицы; состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающей наименований.
