Введение к работе
Актуальность работы
Картофель в качестве продовольственной культуры потребляют более 3-х млрд человек населения планеты, и его выращивают в 150 странах мира. Одна из проблем производства картофеля состоит в том, что он в значительной степени поражается вирусными, бактериальными и грибными заболеваниями и вредителями. Восприимчивость картофеля к болезням и вредителям сделала его культурой номер два в мире по использованию пестицидов. Экономическая ситуация в России требует создания новых сортов картофеля, отличающихся от сортов «интенсивного типа», которые были главной задачей селекции в период 90-х годов прошлого века. Современные сорта должны обладать комплексной устойчивостью к вирусным заболеваниям к фитофторозу, колорадскому жуку и к цистообразующим нематодам. Кроме того, в каждой конкретной зоне возделывания картофеля существуют патогены локального значения. В Сибири, где длинная холодная весна и жаркое сухое лето, возделываемые сорта должны обладать устойчивостью к ризоктониозу. Использование методов биотехнологии и генетической инженерии открывает новые перспективы получения таких растений. Нельзя утверждать, что с помощью одной лишь сельскохозяйственной биотехнологии можно решить все имеющиеся в мире проблемы, связанные с нехваткой продовольствия, но также и нельзя настаивать на том, что необеспеченность продовольствием можно устранить без применения биотехнологии. Необходимость внедрения в сельское хозяйство нетрадиционных технологий, которые позволили бы поднять на новый уровень производство продуктов питания, в последние годы ощущается все с большей остротой. Для селекционного процесса аспекты клеточной биотехнологии растений имеют огромные перспективы. Одно из важнейших направлений в биотехнологии растений занимает клеточная селекция. Методы клеточной селекции лежат в основе ряда технологий промышленного выращивания клеточных культур, а также оздоровления от вирусных и других инфекций вегетативно размножаемых культур.
Наряду с прикладными биотехнологическими аспектами применения новых подходов селекции неоценимо значение этих работ для развития фундаментальных вопросов генетики и эпигенетики, а также молекулярной биологии и физиологии растений.
Настоящее исследование имеет теоретико-прикладной характер и представляет определенный интерес: как в биологическом, так и в генетико-селекционном плане.
Цель и задачи исследования
Цель заключалась в оценке фенотипической и генетико-биохимической изменчивости в культуре картофеля in vitro под воздействием экзогенных факторов и выявлении возможности использования данной изменчивости в создании новых методов селекции.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Проанализировать фенотипы спонтанных сомаклональных вариантов,
возникающих при регенерации в культуре картофеля in vitro, и почковых вариаций.
Выявить возможность использования культурального фильтрата Rhizoctonia solani в качестве селективного фактора для получения форм картофеля, устойчивых к данному патогену
Изучить влияние фитогормонального состава сред и других экзогенных факторов культивирования in vitro на экспрессию генов, контролирующих синтез белка
и аминокислотный состав растворимых белков картофеля, на разных стадиях дифференциации.
4. Проследить влияние фитогормонального состава сред культивирования и
стадии дифференциации на экспрессию генов, контролирующих изоферментны.
Оценить возможность использования бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, в качестве противовирусного препарата при оздоровлении картофеля от вирусной инфекции методом апикальной меристемы, при микроклональном размножении и создании трансгенных форм.
Создать коллекцию генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы от вирусной и грибной инфекции, и показать преимущество использования оздоровленного картофеля в оригинальном семеноводстве Западно-Сибирского региона для получения высоких урожаев экологически безопасного товарного картофеля.
Научная новизна работы
Установлено, что наблюдаемая в ходе онтогенеза изменчивость экспрессии генов, кодирующих растворимые белки и изоферменты, в культуре in vitro носит обратимый характер.
Разработан метод селекции на устойчивость к патогенному грибу Rhizoctonia solani на основе использования культурального фильтрата данного гриба в качестве селективного фактора. Показано, что можно получать направленные сомаклональные изменения, проводя отбор с помощью селективных факторов не только на клеточном уровне, но и на уровне интактных растений, что позволяет вести селекцию, минуя стадию регенерации, являющуюся самым «узким» местом в процессе получения направленных изменений.
Разработан метод оздоровления картофеля от вирусной инфекции путем воздействия бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens на культивируемую апикальную меристему, и получены генетически модифицированные растения картофеля, экспрессирующие ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens на сорте Белоярский ранний.
Практическая значимость работы
Разработанный метод оздоровления картофеля от вирусной, бактериальной и грибной инфекций путем применения в качестве хемиотерапевтического препарата бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, помогает не только существенно повысить выживаемость вычленяемой меристемы, но и увеличить выход здоровых растений из регенерировавших меристем. Это существенно облегчает и удешевляет биотехнологические стадии в семеноводстве как самые трудозатратные при оздоровлении картофеля и служит стимулирующим фактором при микроклональном размножении.
На основе разработанного метода создана коллекция генофонда оздоровленного картофеля, которая служит базовым фондом для оригинального семеноводства в Западно-Сибирском регионе.
На основе использования в качестве селективного фактора культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani получены формы картофеля, устойчивые к ризоктониозу.
Результаты исследований использованы и внедрены:
Полученные в данной работе результаты позволяют дать следующие рекомендации.
Следует шире применять методы клеточных технологий в сочетании с отбором для получения исходного материала с ценными селекционными признаками.
Для создания устойчивых сортов следует применять разработанный нами метод получения устойчивых к К soliani форм на основе использования для отбора интактных растений вместо клеточной культуры.
3. При оздоровлении картофеля методом апикальной меристемы целесообразно
использовать нуклеазы, которые не только снижают уровень вирусной инфекции, но и
стимулируют приживаемость вычлененных меристем и увеличивают выход
безвирусных растений.
4. Для семеноводства картофеля необходимо обязательно использовать оздоровленный
материал и выращивать из него товарную продукцию, используя 4-6-ую репродукции
после миниклубней, так как, начиная с 7-ой репродукции, резко сокращается
продуктивность растений и лежкость клубней. Индивидуальным производителям
необходимо передавать семенной материал 2-3-го года репродукции после
миниклубней, поскольку они сами еще в течение последующих 2-3 лет наращивают
посадочный материал.
Апробация работы
Основные результаты были представлены на: 4-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987); 5-м Съезде ВОГиС (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); Межреспубликанском совещании "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989); Международной конференции «Частная генетика растений» (Киев, 1989); Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений" (Алма-Ата, 1993); Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений" (Киев, 1994); 6-ом Съезде ВОГИС (Саратов, 1994); 3-ем Российском семинаре "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995); Международной конференции "Биология клеток растений, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997); "Third International symposium in Rhizoctonia" [ISR-2001] National Chung Hsing University Taichung (Taiwan, 2001); Генетико-селекционных школах (Новосибирск, 1994, 1999, 2004); Международной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); IV Международной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002,); Международных конференциях Института картофелеводства НАН Беларуси (Минск, 2003, 2007, 2008); 2-ой Конференции Московского общества генетиков и селекционеров имени Н.И.Вавилова (Москва, 2003); Международной научно-практической конференции «Современные технологии производства сельскохозяйственных культур в Сибири» (Новосибирск, 2005); Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение картофелеводства Сибири и Дальнего Востока: состояние, проблемы и перспективные направления» (Кемерово, 2006); Международной конференции «Научное наследие Н.И.Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007).
В 1991г. работа была награждена серебряной медалью ВДНХ СССР «За научные разработки по применению бактериальной эндонуклеазы в борьбе с вирусным вырождением картофеля». В 2000 г. на Сибирской ярмарке на выставке «Наука 2000 городу и области» за создание коллекции генофонда оздоровленного картофеля работа была награждена малой золотой медалью выставки.
Публикации, авторские свидетельства, патенты
По теме исследования опубликовано 34 работы, в том числе 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.
Издан каталог «Распространенные и перспективные сорта картофеля коллекции ИЦиГ СО РАН».
Кроме того, получено авторское свидетельство «Способ выращивания картофеля» от 15.04.1990г. № 1585328 и патент «Способ селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу» № 2217906 от 10.12.2003 г., Москва.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста, состоит из следующих глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение исследования, Использование в семеноводстве, Выводы и Литература. Библиографический указатель включает 276 источников, из них 93 публикаций в отечественной литературе, 183 в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и содержит 26 таблиц.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Изменения в культуре in vitro можно вызвать как на клеточном уровне, так и
на уровне интактных растений, а, используя селективные факторы, можно получать
направленные изменения. Это показано в селекционном процессе с помощью
разработанного нами метода получения устойчивых к Rhizoctonia solani растений
картофеля.
2. Экспрессия генов, контролирующих синтез растворимых белков и
изоферментов, а также аминокислотный состав, изменяются в зависимости от стадии
дифференциации в культуре in vitro. Возникающие новые состояния экспрессии генов
стабильны в период прохождения той или иной стадии дифференциации, но носят
обратимый характер: спектры белка и изоферментов при переходе от интактных
растений к каллусной культуре изменяются, но у растений-регенерантов вновь
восстанавливаются, что указывает на наличие процессов репрессии и дерепрессии
генов в зависимости от стадии дифференциации. Стабильность и обратимость
выявляемых изменений свидетельствует о том, что данные изменения могут иметь
эпигенетическую природу.
В культуре in vitro электрофоретические спектры растворимых белков и изоферментов изменяются в зависимости от фитогормонального состава сред культивирования.
Бактериальная эндонуклеаза, продуцируемая Serratia. marcescens, обладает как противовирусным, так и стимулирующим эффектом при оздоровлении картофеля методом апикальной меристемы и при микроклональном размножении. Стимулирующий эффект от воздействия эндонуклеазы в культуре in vitro сохраняется и после высадки обработанной пробирочной культуры в почву.
