Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Носков Андрей Анатольевич

Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах
<
Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Носков Андрей Анатольевич. Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах : Дис. ... канд. техн. наук : 03.00.23 : Щелково, 2004 133 c. РГБ ОД, 61:05-5/494

Содержание к диссертации

Введение

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Основные свойства 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов 12

1.2. Методы выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред 19

1.3. Общие сведения об экстракции гидрофильных органических оснований 23

1.4. "Переносчики'1 для экстракции 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов 29

1.5. Органические растворители для экстракции 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38

1. Материалы и методы 38

1.1. Объекты исследования 3 8

1.2. Методы исследования 39

1.2.1. Методы ведения технологических процессов 39

1.2.2. Методы контроля ведения технологических процессов 42

1.2.3. Методы контроля показателей качества препаратов 46

1.3. Обработка результатов 46

2. Выбор условий, "переносчиков" и растворителей для экстракционного

выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов 50

2.1. Выбор условий экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред 50

2.2. Выбор системы "растворитель-переносчик" для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных растворов 54

2.2.1. Выбор органического растворителя для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред растворами "переносчиков" 54

2.2.2. Выбор "переносчиков" для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водныз сред 58

3. Выбор оптимальных условий экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных растворов 61

3.1. Изучение влияния значения рН раствора на экстракцию 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов 61

3.2. Изучение влияния мольного соотношения реагентов на экстракцию 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов 62

3.3. Изучение влияния продолжительности процесса экстракции на полноту извлечения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водного раствора в ионный ассоциат 64

3.4. Выбор условий реэкстракции 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из системы антибиотик-"переносчик" 67

4.5. Экстракция 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из нативных растворов 69

4. Разработка экстракционно-фотометрического метода определения концентрации 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в технологических растворах 72

4.1. Выбор оптимальных условий проведения экстракционно-фотометрического определения концентрации 4,6 замещенных

2-дезоксистрептаминов в технологических растворах 72

4.1.1. Выбор "переносчика" для фотометрического определения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов 77

4.1.2. Выбор органического растворителя для экстракции ассоциата 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов с бромтимоловым синим в органическую фазу 83

4.1.3. Изучение влияния рН водного раствора на экстракцию ионного ассоциата антибиотик-краситель 85

4.2. Разработка методики определения концентрации бромтимолового синего в водных растворах 89

4.3. Исследование зависимости между концентрацией 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в водном растворе и количеством красителя, связанного в ионный ассоциат с антибиотиком 4.3.1. Исследование зависимости между концентрацией 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в водном растворе и оптической плотностью хлороформных экстрактов 4.3.2. Исследование зависимость между концентрацией 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в водном растворе и разностью концентраций красителя в водном растворе до и после экстракции

5 Оценка воспроизводимости полученных результатов исследований

5.1. Оценка воспроизводимости разработанного метода выделения 4,6 замещенных 2 дезоксистрептаминов экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком"

5.2. Оценка воспроизводимости разработанного экстракционно- фотометрического метода определения концентрации 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

IV. ВЫВОДЫ

V. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

VI РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

VII. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение к работе

Среди многочисленных лекарственных средств, применяемых в медицинской и ветеринарной практике, большое значение приобрели препараты, получаемые в результате микробиологического синтеза. К ним в первую очередь относятся антибиотики.

В ряду антибиотиков широкого спектра действия важное место занимают аминогликозидные препараты и, в частности, 4,6 замещенные 2-дезоксистрептамины (АМГ) — гентамицин, тобрамицин и апрамицин. Следует отметить, что до настоящего времени производство тобрамицина и апрамицина в нашей стране отсутствует.

Аминогликозиды проявляют бактерицидное действие в отношении большинства грамположительных и грам отрицательных микроорганизмов. В терапевтических концентрациях они активны против Е. соН, Salmonella, Shigella, Brucella, Proteus, Staphylococcus и ряда других микроорганизмов. Большое значение имеет активность аминогликозидов, и в частности, тобрамицина, в отношении синегнойной палочки. Апрамицин, хорошо зарекомендовал себя в ветеринарии. Препарат весьма эффективен при сальмонеллезах, колибактериозах, стафилококковых и стрептококковых инфекциях.

В настоящее время зависимый от импорта выпуск антибиотиков не может способствовать развитию России как полноценного самостоятельного государства, которое преследует свои национальные интересы, поскольку зависимость от импортных поставок влияет на экономическую безопасность страны.

Выпуск качественных препаратов АМГ вызывает в свою очередь необходимость наличия высокоэффективных и экспрессных методов выделения и очистки антибиотиков, позволяющих снизить материальные и временные затраты без снижения качества получаемых продуктов. Увеличение объема производства требует использования простых в технологическом исполнении и недорогих методов, позволяющих осуществлять эффективный контроль производства выпускаемой продукции. При этом своевременность и адекватность анализа препарата на различных технологических стадиях позволяет оперативно влиять на процесс производства.

Как и в технологии получения, так и в физико-химических методах, используемых для контроля содержания АМГ в технологических растворах, их выделение и разделение осуществляется преимущественно сорбционными методами. Если на стадии выделения основной задачей является максимальное извлечение антибиотика из КЖ, то при контроле содержания их немаловажную роль играет достоверность и оперативность проведения анализа.

Как метод выделения, ионообменная сорбция обеспечивает получение антибиотиков высокого качества без использования дорогостоящих пожаровзрывоопасных растворителей и дает возможность получать антибиотик из культуральной жидкости или из грубоотфильтрованных растворов. Наряду с несомненными достоинствами ионообменная сорбция обладает и рядом недостатков, например, использование громоздкого оборудования, занимающего большие производственные площади; значительные затраты физического труда при обслуживании оборудования; длительность и многооперационность процесса выделения и очистки; большие потери и значительный расход реагентов (воды, минеральных кислот и щелочей).

Одним из направлений интенсификации процесса выделения является использование экстракционных методов, которые просты в исполнении, не требуют сложного и дорогостоящего оборудования и позволяют осуществлять процесс за короткие промежутки времени.

В связи с этим, актуальность работы обусловлена необходимостью разработки эффективных и экспрессных способов выделения АМГ из водных сред, к которым относятся экстракционные методы, например экстракция с "переносчиком".

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Провести теоретическое и экспериментальное изучение процесса взаимодействия АМГ с "переносчиками".

2. Разработать оптимальные условия экстракционного выделения ЛМГ из водных сред с растворимым в органической фазе "переносчиком".

3. Оценить возможность выделения гентамицина и тобрамицина из нативного раствора.

Разработать оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред с растворимым в водной фазе "переносчиком";

Разработать методику определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом;

6. Оценить воспроизводимость разработанного метода экстракционного выделения и методики определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом и произвести сравнительную их оценку с существующими методами.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование процесса взаимодействия АМГ с рядом органических реагентов и на основе проведенных исследований выбраны оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред и экстракционно-фотометрического определения их концентрации технологических растворах.

Впервые разработан метод экстракционного выделения гентамицина, тобрамицина и апрамицина с растворимым в органической фазе "переносчиком".

Впервые разработана универсальная методика определения концентрации АМГ в технологических растворах, основанная на определении разности концентраций красителя, связанного в ассоциат с АМГ, и свободного красителя.

Практическая значимость работы. Разработанный метод выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" позволяет сократить время проведения процесса выделения гентамицина в 10 раз, тобрамицина в 18,5 раз при сохранении количественного выхода полупродуктов.

Разработанная методика определения концентрации АМГ экстракщюнно-фотометрическим методом позволяет сократить время проведения анализа с 20-24 до 2 часов, что дает возможность оперативно корректировать процесс производства.

Публикации и апробация работы.

Основные положения работы обсуждались на итоговых научных конференциях Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ (г. Екатеринбург, 1996-2002 гг.), на юбилейной научной конференции НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998), на юбилейной научной конференции Центра ВТП БЗ (г. Екатеринбург, 1999), на V молодежной школе - конференции по органической химии (УрО РАН г. Екатеринбург, 2002 г.). Две статьи с результатами исследований опубликованы в журнале "Ветеринарная медицина" ("Изучение возможности применения экстракционных методов в технологии выделения и очистки апрамицина" и "Способ выделения апрамицина" № 1(3), 2003 г.).

Положения выдвигаемые на защиту:

Метод выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком"

Методика определения концентрации АМГ экстракционн о- фотометрическим методом.

Данные сравнительной оценки выделения АМГ экстракционным и сорбционным методами.

Данные сравнительной оценки определения концентрации АМГ а технологических растворах экстракционно-фотометрическим и микробиологическим методами.

Структура и объем диссертации. Работа включает в себя введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение результатов, основные выводы о проделанной работе, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы включающий 88 источников, из них 22 - зарубежных авторов и приложения. Материал диссертации изложен на 139 стр., иллюстрирован 33 рисунками 34 таблицами.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные свойства 4,6-замещенных 2-дезоксистрептаминов

По своей химической природе АМГ являются псевдоолигосахаридами. Молекулы соединений состоят из двух принципиально различных частей. Одна часть - углевод, содержащий, по крайней мере, одну аминогруппу, вторая - агликон. Агликоном является аминоциклит. Наиболее ценные по своим антибактериальным свойствам антибиотики содержат в качестве аминоциклита дезоксистрептамин [11, 12].

В зависимости от природы углеводного заместителя у атома С(6) они делятся на две многочисленные группы. Первую образует семейство канамициновых антибиотиков, для которых характерно наличие у С (6) дезоксистрептаминового кольца З-амино-З-дезокси-а-О-глюкозы. Наиболее широко в медицинской практике в настоящее время из данной группы АМГ используются канамицин А (рисунок 1) и тобрамицин (рисунок 2) [13-15].

канамицин A: R1 = Н, R2 = R3 = R4 = ОН, R5 = R6 = NH2;

Рисунок 1. Структура канамициновых антибиотиков

Небрамициновый комплекс, продуцируемый Streptomyces cremeus subsp. Tohramycini, включает в себя три основных компонента: карбамоилтобрамицин, апрамицин и карбамоилканамицин В (рисунок 2). Кроме того, в состав небрамицинового комплекса входит около 10 минорных компонентов [16, 17]. В настоящее время из всего небрамицинового комплекса в качестве лекарственного препарата для лечения людей находит применение только тобрамицин. Апрамицин (рисунок 3) используется в ветеринарной практике [17].

Карбамоилтобрамицин: R1- R4=OH, R2=R5=R6=NH2, R3=CONH2,

Тобрамицин: R^R^H, R2=R5=R6=NH2, R4=OH

Карбамоилканамицин В: R1=H, R4=R5=OH, R3=CONH2, R2=R6=NH2

Канамицин В: R^R3=H, R2=R6=NH2, R4=R5=OH

Рисунок 2. Основные компоненты небрамицинового комплекса

Вторую группу составляют гентамициновые антибиотики (рисунок 4), дезоксистрептаминовое кольцо которых у атома С(6) имеет либо гарозамин, либо 3 -метилам ино-3 -дезоксип ентапиранозу [14].

Рисунок 3. Структурная формула апрамицина

Пурпурозамин

Гарозамин R'-NH I

Гентамищш Ci: R=CH3,R -СН3 Гентамицин С2: R=CH3,R-Н Гентамицин С ід: R=H, R1=H

Рисунок 4. Основные компоненты гентамицинового комплекса

Среди АМГ данной группы наиболее важны в терапевтическом отношении гентамицин и сизомицин.

Образуемая Micromonospora purpurea группа гентамицинов содержит несколько аминогликозидных антибиотиков. В качестве лечебного препарата в настоящее время используется смесь трех гентамицинов - так называемый комплекс гентамицинов С - Сь С]д, С2 (рисунок 4) [18-21].

Аминоциклитол гентамицина соединен с двумя аминосахарами - гарозамином и пурпурозамином. Пурпурозамин у всех трех компонентов гентамицина не содержит гидроксильных групп при С-3* и С-4', которые наиболее уязвимы в отношении аминогликозидинактивирующих ферментов. Вторая особенность, повышающая эффективность гентамицинов С-комплекса против резистентных к ряду других аминогликозидов микроорганизмов, характерна только для пурпурозаминовых остатков гентамицинов Сі и С^.

Эта особенность заключается в защите от энзиматической модификации аминогруппы при С-6'; либо аминогруппа замещена (-NHCH3), либо метальный остаток при С-6', заменяющий один из атомов водорода, ее экранирует. Аминогруппа в гарозамине также замещена метильной группировкой. Отмеченные особенности химического строения гентамицина обеспечили ему широкий спектр антибактериального действия и позволили успешно конкурировать с препаратами этой группы.

Синтез любого антибиотика гентамштинового комплекса сопровождается образованием гентамицинов Аь Аг, A3, А4, В, Вь X, составляющих так называемые "гентамициновые примеси" [18, 19].

Пурпурозамин у всех семи компонентов гентамициноподобных примесей при С-3', С-4' содержит гидроксильные группы. У гентамицинов А1: А2, А3, А4 нет метильной группы в положении С-4" гарозамина, а в пурпурозамине в положении С-5' (Ai, А2, А4, X) находится группировка СН2ОН. Таким образом, это не завершенный по синтезу гентамицин. Изменение оптического положения гидроксила в С-4' и замена в С-3" амина на гидроксил дает образование гентамицина А2. Гентамицин В, В[ в положении С-2' имеет гидроксил вместо аминогруппы. Химическая структура перечисленных выше антибиотиков гентам и цинового ряда определяет их большую доступность для аминогликозидинактивирующих ферментов по сравнению с гентамицинами С, вследствие чего они представляют мало интереса для лечебной практики [21, 22].

Поскольку АМГ являются псевдоолигосахаридами, то естественно, что для них характерны многие физико-химические свойства и реакции, присущие олигосахаридам.

Антибиотики - АМГ и их соли - бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде и нерастворимые в органических растворителях, они весьма устойчивы при длительном хранении как в порошкообразном, кристаллическом состоянии, так и в водных растворах. У них отсутствует поглощение в ультрафиолетовой и видимой области спектра и, в большинстве случаев, нет характеристических полос поглощения в ИК-спектрах. Поэтому для изучения структуры АМГ в настоящее время используют, главным образом, спектроскопию ЛМР- С и масс-спектром етрию.

Спектры ПМР АМГ весьма сложны и требуют использования модельных соединений при расшифровке [22-25]. Спектроскопия ЯМР 15N использована при изучении соединений небрамицинового комплекса [26-29].

Кристаллические АМГ прочно удерживают влагу и углекислый газ, легко адсорбируются целлюлозой, целитом и другими фильтрующими материалами, причем полное количество антибиотика не может быть возвращено даже при подкислении [26].

Химические свойства АМГ определяются наличием у них гликозидных связей, гидроксильных и аминогрупп.

Гидролитическая устойчивость большинства из них определяется стойкостью к гидролизу гликозидной связи. Поскольку разрушение гликозидной связи возможно лишь в сильнокислых водных растворах, АМГ устойчивы в слабокислых, нейтральных и щелочных средах.

Значительное число аминогрупп, входящих в молекулы АМГ, придают им выраженные основные свойства. Для АМГ константы ионизации (рКа) характеризуют кислотные свойства протонированной аминогруппы. В таблице 1 приведены значения показателей кислотности АМГ [11, 14].

Таблица 1

Показатели кислотности 4,б-замещенных 2-дезоксистрептаминов

Схема диссоциации АМГ представлена на рисунке 5. r^. pKi , 44- РКа <*j- РКз о, Р«4 + оКэ

АН55+^АН44+^=»-АН3з+^АН^^АН ^АН

Рисунок 5. Схема диссоциации 4,6-замещенных 2-дезоксистрептаминов

На основании анализа литературы о значениях константы диссоциации (рКа) АМГ [11, 30] можно сделать вывод, что наиболее полное протонирование аминогрупп (практически нацело) происходит при рН<3.

В кислых растворах (рН<3) число положительных зарядов на АМГ максимально, т.е. равно числу аминогрупп. При повышении рН до значений 6,0-7,0 в системе остается заметная доля молекул в полностью ионизированной форме, но наряду с ними появляются молекулы с более низкими степенями ионизации вплоть до нулевой.

Аминогруппы АМГ расположены в различных по своей природе фрагментах молекул и имеют разное окружение, тем не менее, в большинстве случаев они практически одинаковы по реакционной способности, и химическая трансформация осуществляется одновременно по всем группам.

Наиболее характерными реакциями -ОН групп АМГ являются реакции образования сложных и простых эфиров. Гидроксильные группы АМГ, также как и аминогруппы близки по своей реакционной способности друг к другу, но также как и в случае с аминогруппами гидроксильные группировки все же незначительно различаются по своей реакционной способности. Наиболее активными являются первичные спиртовые ОН- С-3" группы при С-6", или С-6', несколько менее активны С-2" и С-2'-гидроксилы. Остальные ОН-группы практически одинаковы по реакционной способности [6,14, 31-32].

С альдегидами в вводно-спиртовых средах АМГ легко образуют основания Шиффа[б,31].

При взаимодействии с хлорангидридами алкил- и арилсульфокислот АМГ легко образуют сульфонаты, которые используются для введения в молекулу антибиотика различных функциональных заместителей (галогенов, СООН, NH2 и т.п.) по реакции обмена сульфонилоксигрупп.

При кислотном гидролизе АМГ происходит разрыв гликозидных связей. Продуктами длительного гидролиза являются отдельные циклические фрагменты молекулы — цикл игольный компонент и моносахара.

Таким образом, АМГ являются довольно стабильными химическими соединениями, хорошо растворимыми в водных растворах. К основным их свойствам .можно отнести высокую гидрофильность и отсутствие их растворимости в неполярных растворителях. Наличие большого числа амино- и гидроксильных групп придает им свойства сильных оснований- Благодаря этому АМГ легко образуют соли или ассоциаты.

Высокая гидрофильность аминогликозидов и, как следствие, отсутствие их экстрагируем ости из водных растворов органическими растворителями позволяет использовать для их извлечения в органическую фазу лишь метод экстракции с использованием "переносчика", образующего с антибиотиком ионный ассоциат, хорошо растворимый в органическом растворителе.

1.2. Методы выделения 4,6-замещенных 2-дезоксистрсптамииов из водных сред

Антибиотики - АМГ (канамицин, гентамицин, тобрамицин, апрамицин и им подобные антибиотики - аминоциклитолы) выделяют из сложных многокомпонентных гетерогенных систем, получаемых путем биологического синтеза.

Технологический процесс выделения включает в себя, как правило, отделение мицелия с помощью фильтрационного оборудования и извлечение целевых продуктов из раствора с помощью различных способов, к которым предъявляют следующие требования [10]: высокая избирательность к антибиотику; потери при использовании того или иного способа должны быть минимальны, кроме того, он должен обеспечивать достаточное концентрирование антибиотика; возможность осуществления процесса при комнатной температуре; осуществление процесса извлечения целевого продукта в небольшой промежуток времени.

В настоящее время для этих целей используют осаждение, экстракцию, различные сорбционньте методы.

Метод осаждения применим в том случае, когда есть реагент, с помощью которого антибиотик можно перевести в нерастворимое состояние, если есть возможность его отфильтровать, а затем в специально подобранном растворителе перевести его обратно в свободное состояние для дальнейшей очистки.

Для выделения АМГ используют метод осаждения в виде солей с различного рода осадителями. Поскольку АМГ являются органическими основаниями, в качестве осадителей применяют некоторые кислотные реагенты, осаждающие амины, например, жирные кислоты.

Так, в качестве осадителей АМГ испытывались вольфрамовая, кремний вольфрамовая, пикриновая, лауриновая, лаурилсульфоновая и другие кислоты, причем максимальная степень осаждения достигалась при использовании вольфрамовой кислоты. Используют также некоторые кислотные красители, например конго красный, нафтоловый сине-черный, оранжевый II [7-10].

Методом осаждения достигается быстрое концентрирование антибиотика при комнатной температуре, отсутствуют органические растворители и, следовательно, он пожаровзрывобезопасен, как правило, недорог и прост в аппаратурном оформлении. Основной недостаток данного метода заключается в сложности подбора вещества, которое бы селективно связывалось с нужным соединением, в связи, с чем он, как правило, характеризуется плохой избирательностью процесса,

Сорбционные методы основаны на поглощении веществ сорбентом из жидкой фазы. Они позволяют извлекать антибиотик из очень разбавленных растворов без воздействия сильных реагентов. В зависимости от объекта сорбции сорбционные процессы бывают двух типов: в одном случае сорбент поглощает сопутствующие вещества, не являющиеся целевыми продуктами, в другом случае целевой продукт остается на сорбенте и далее подвергается десорбции. Рациональная сорбционная технология должна основываться на правильном выборе сорбента и условий проведения процесса.

Ионообменная сорбция АМГ изучена преимущественно на карбоксильных катионитах, а также на алюмосиликатных сорбентах. Причинами подобного выбора ионитов и ограниченного использования сульфокатионитов для выделения этих антибиотиков являются большая селективность карбоксильных катионитов, их пониженная способность сорбировать слабые основания и большая поглотительная способность но отношению к достаточно сильным основаниям - аминоциклитолам [7-Ю].

Как метод выделения, ионообменная сорбция обеспечивает получение антибиотиков высокого качества без использования дорогостоящих пожаровзрывоопасных растворителей и дает возможность получать антибиотик из культуральной жидкости или из грубоотфильтрованных растворов. Наряду с несомненными достоинствами ионообменная сорбция обладает и рядом недостатков, например, использование громоздкого оборудования, занимающего большие производственные площади; значительные затраты физического труда при обслуживании оборудования; длительность и многооперационность процесса выделения и очистки; большие потери и значительный расход реагентов (воды, минеральных кислот и щелочей).

Метод экстракции является универсальным, так как позволяет выделять антибиотик, как из твердой, так и из жидкой фазы. Гораздо чаще в производстве используют экстракцию из растворов. Этот метод еще называют "методом замены растворителя". При изменении величины рН раствора антибиотик обладает большим сродством к другому растворителю, который не смешивается с первым. Под термином экстракция понимают совокупность следующих процессов: собственно экстракцию (приведение в контакт двух несмешивающихся растворителей, в одном из которых находится антибиотик; во время этого контакта происходит переход антибиотика из одного растворителя в другой) и сепарацию -последующее разделение эмульсий. Процесс экстракции, как правило, проводят многократно. При этом происходит концентрирование антибиотика и освобождение его от примесей.

Экстракционные способы выделения применимы в тех случаях, когда вещество хорошо растворяется в органических растворителях и извлекается ими из водной фазы. Широкое применение экстракция нашла в технологиях выделения и очистки беталактамов, макролидов и тетрациклинов. Гидрофильные вещества выделяют преимущественно осаждением и сорбционными способами.

Поскольку АМГ прекрасно растворимы в воде и практически нерастворимы в органических растворителях, то применение к ним "прямой экстракции" невозможно.

Разновидностью экстракционного процесса является экстракция с "переносчиками", которые используются для снижения растворимости выделяемого вещества в воде и повышения его растворимости в несмешивающемся с водой растворителе. В качестве "переносчиков" могут быть использованы, например, высшие жирные кислоты, цетазол и другие вещества [8].

В настоящее время известны работы по использованию "переносчиков" для извлечения аминокислот, тетрациклина, окситетрациклина, стрептомицина, канамицина [33-36]. Так для стрептомицина, такими веществами-"переносчиками" являются различные жирные кислоты (С8 - С[5), например, лауриновая, стеариновая, и другие, сульфированные алифатические спирты, анионные детергенты типа арил или алкилсульфокислот. В качестве экстрагирующего растворителя применяют амиловый спирт, который полностью- извлекает из водной фазы (при рЫ 9) соединение стрептомицина с переносчиком. При последующем подкислении минеральной кислотой достигается высвобождение стрептомицина. Из водного раствора после нейтрализации и концентрирования в вакууме, стрептомицин высаждают ацетоном (или другим реагентом) или же полученный концентрат непосредственно подвергают дальнейшей очистке [10].

В качестве экстрагирующего растворителя используют несмешивающиеся с водой первичные алкил- или ариламиньт (например, 2-аминогептан), которые вступают в реакцию со стрептомицином (по карбонильной группе), образуя легко расщепляемые основания Шиффа. Описан также метод экстракции стрептомицина и дигидроксистрептомицина фенолами [65-68, 74].

Показана возможность извлечения канамицина из несмешивающихся с водой органических растворителей (амилового спирта, бутилацетата) при рН 7-9 в присутствии жирных кислот или хлор фенолов [8].

Если в качестве "переносчика" использовать вещество, имеющее характерное поглощение в видимой области спектра, то это позволит одновременно осуществить как отделение антибиотиков от примесей, так и получение окрашенных экстрактов для последующего фотометрического анализа. Такой метод, получивший название экстракционно-фотометрического, нашел широкое применение в анализе фармацевтических препаратов [37-45].

Сотрудниками Ленинградского НИИ антибиотиков для определения концентрации веществ основного характера в КЖ предложено использовать экстракцию с "переносчиком", растворимым в водной фазе [46]. В качестве переносчика используется кислотные красители. Молекулы красителя за счет имеющейся у них сульфогруппы образуют ионные пары с протонированными аминогруппами органических оснований. Образующийся ассоциат достаточно гидрофобен для извлечения его в органическую фазу, в качестве которой используются органические растворители. Благодаря наличию характерного поглощения у кислотных красителей в видимой области спектра, образующийся комплекс окрашен, что позволяет по оптической плотности органических экстрактов определять концентрацию основания в растворе.

Таким образом, ввиду того, что АМГ являются гидрофильными органическими основаниями, наибольшее распространение для их выделения нашли сорбционные способы на карбоксильных катионитах типа КБ-2 и КБ-4-2ГТ.

Для осаждения АМГ могут использоваться жирные кислоты, сульфокислота (лауриновая и лаурилсульфоновая кислоты) а также некоторые красители, например конго красный, нафтоловый сине-черный, оранжевый I).

Хорошая растворимость АМГ не позволяет использовать для их выделения метод прямой экстракции. Однако использование разновидности экстракционного способа выделения - экстракции с "переносчиком" позволяет выделять АМГ.

Выделение АМГ экстракцией с "переносчиком" может использоваться как в технологии выделения антибиотика, так и для выделения и последующего анализа (определения концентрации) его в технологических жидкостях.

1.3, Общие сведения об экстракции гидрофильных органических оснований

Экстракция представляет собой распределение, т.е. одновременное и взаимосвязанное растворение вещества в двух соприкасающихся жидких фазах. При растворении образуются малопрочные соединения растворенного вещества с растворителем. Межфазовое равновесие достигается в результате влияния ряда факторов, действующих между молекулами экстрагируемого вещества и экстрагента [47]. Одним из таких факторов является взаимодействие за счет ван-дер-ваальсовских сил, наблюдаемых между незаряженными молекулами (физический механизм экстракции). Силы Ван-дер-ваальса проявляются во всех реальных системах и не имеют направленности. Экстракция только за счет сил Ван-дер-ваальса наблюдается при извлечении алифатических соединений алифатическими углеводородам и.

Вторым видом взаимодействия является сольватация молекулы экстрагируемого вещества одной или несколькими молекулами экстрагента с образованием сольвата определенного состава (специфическая сольватация). Сольватация происходит вследствие донор но-акцептори ого взаимодействия (образование тг-комплексов) или под влиянием межмолекулярных водородных связей. Эти взаимодействия отличаются выраженной направленностью.

Третьей причиной экстракции может быть химическое взаимодействие растворенного соединения с экстрагентом или со специально введенными реактивами, приводящее к образованию экстрагируемых соединений. Сюда относятся экстракция веществ в виде солей, ионных ассоциатов, комплексных соединений [47-49].

Силы, действующие между молекулами экстрагируемого вещества и экстрагента, по влиянию на константы распределения можно расположить в следующий ряд: водородные связи > связи в тг-комплексах > силы Ван-дер-ваальса. В экстракционных процессах разрушаются связи между молекулами растворителя и образуются ассоциаты экстрагируемого вещества и растворителя [50], Переход экстрагируемого вещества из одной фазы в другую сопровождается изменениями в сольватной оболочке соединения, а иногда и изменением его состояния. Переход вещества в органическую фазу преимущественно приводит к образованию ассоциированных молекул.

При экстракции органических молекул с плохо гидратируемыми неполярными участками наблюдается гидрофобное взаимодействие, которое приводит к ассоциации неполярных групп, в результате чего уменьшается контакт органических молекул с молекулами воды, следовательно, и растворяемость в воде. Все эти факторы благоприятствуют переходу вещества из водного раствора в фазу экстрагента [51].

Гидрофобное взаимодействие имеет место и при образовании ионных ассоциатов. Последние, в отличие от образующих их ионов, электронейтральны, поэтому они менее гидратированы, чем соответствующие ионы. Здесь проявляется гидрофобный эффект, т. е. снижение способности гидратироваться приводит к относительно малой растворимости ассоциата в воде (при достаточной концентрации ассоциатов наблюдается их осаждение) и к заметной способности их извлекаться органическими растворителями [52].

Образование и экстракцию ионного ассоциата можно проиллюстрировать в виде схемы, представленной на рисунке 5 [51].

Ионный ассоциат образуется в водном растворе. Даже нитраты и галогениды щелочных металлов в водных растворах ионизируют далеко не полностью, т. е. они в той или иной степени существуют и в виде ионных пар. 1-

Основные свойства 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

По своей химической природе АМГ являются псевдоолигосахаридами. Молекулы соединений состоят из двух принципиально различных частей. Одна часть - углевод, содержащий, по крайней мере, одну аминогруппу, вторая - агликон. Агликоном является аминоциклит. Наиболее ценные по своим антибактериальным свойствам антибиотики содержат в качестве аминоциклита дезоксистрептамин [11, 12].

В зависимости от природы углеводного заместителя у атома С(6) они делятся на две многочисленные группы. Первую образует семейство канамициновых антибиотиков, для которых характерно наличие у С (6) дезоксистрептаминового кольца З-амино-З-дезокси-а-О-глюкозы. Наиболее широко в медицинской практике в настоящее время из данной группы АМГ используются канамицин А (рисунок 1) и тобрамицин (рисунок 2) [13-15].

Небрамициновый комплекс, продуцируемый Streptomyces cremeus subsp. Tohramycini, включает в себя три основных компонента: карбамоилтобрамицин, апрамицин и карбамоилканамицин В (рисунок 2). Кроме того, в состав небрамицинового комплекса входит около 10 минорных компонентов [16, 17]. В настоящее время из всего небрамицинового комплекса в качестве лекарственного препарата для лечения людей находит применение только тобрамицин. Апрамицин (рисунок 3) используется в ветеринарной практике [17].

Карбамоилтобрамицин: R1- R4=OH, R2=R5=R6=NH2, R3=CONH2,

Тобрамицин: R R H, R2=R5=R6=NH2, R4=OH

Карбамоилканамицин В: R1=H, R4=R5=OH, R3=CONH2, R2=R6=NH2

Канамицин В: R R3=H, R2=R6=NH2, R4=R5=OH

Рисунок 2. Основные компоненты небрамицинового комплекса

Вторую группу составляют гентамициновые антибиотики (рисунок 4), дезоксистрептаминовое кольцо которых у атома С(6) имеет либо гарозамин, либо 3 -метилам ино-3 -дезоксип ентапиранозу [14].

Образуемая Micromonospora purpurea группа гентамицинов содержит несколько аминогликозидных антибиотиков. В качестве лечебного препарата в настоящее время используется смесь трех гентамицинов - так называемый комплекс гентамицинов С - Сь С]д, С2 (рисунок 4) [18-21].

Аминоциклитол гентамицина соединен с двумя аминосахарами - гарозамином и пурпурозамином. Пурпурозамин у всех трех компонентов гентамицина не содержит гидроксильных групп при С-3 и С-4 , которые наиболее уязвимы в отношении аминогликозидинактивирующих ферментов. Вторая особенность, повышающая эффективность гентамицинов С-комплекса против резистентных к ряду других аминогликозидов микроорганизмов, характерна только для пурпурозаминовых остатков гентамицинов Сі и С .

Эта особенность заключается в защите от энзиматической модификации аминогруппы при С-6 ; либо аминогруппа замещена (-NHCH3), либо метальный остаток при С-6 , заменяющий один из атомов водорода, ее экранирует. Аминогруппа в гарозамине также замещена метильной группировкой. Отмеченные особенности химического строения гентамицина обеспечили ему широкий спектр антибактериального действия и позволили успешно конкурировать с препаратами этой группы.

Синтез любого антибиотика гентамштинового комплекса сопровождается образованием гентамицинов Аь Аг, A3, А4, В, Вь X, составляющих так называемые "гентамициновые примеси" [18, 19].

Объекты исследования

Приготовление растворов "переносчиков" для экстракционного выделения ЛМГ из водных растворов

Раствор "переносчика" получали путем растворения концентрата органического вещества в неполярном алифатическом растворителе.

Для получения раствора "переносчика" в стеклянный химический стакан вместимостью 100 см3 заливали 50 см3 растворителя и при перемешивании загружали навеску "переносчика". Смесь перемешивали до полного растворения "переносчика".

Аммиачную форму "переносчика" в органическом растворителе получали двух-, трехкратной обработкой его 12 % раствором аммиака при объемном соотношении "переносчик"-раствор аммиака равном 1:2 в делительной воронке при незначительном перемешивании. После перевода экстрагента в NH4+ форму осторожно промывали его 2-3 раза дистиллированной водой (избегая образования эмульсий).

Приготовление насыщенного водой раствора органического растворителя В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносили 500 см"3 изобутилового спирта и осторожно приливали воду дистиллированную (65 см"3 для амилового спирта и 45 см"3 для бутилацетата). Раствор отстаивали в течение 24 ч при комнатной температуре.

Экстракция АМГрастворами "переносчиков"

В делительную воронку емкостью 50 см пипеткой вносили 10 см водного раствора 4,6-замещенных 2-дезоксистрептаминов, приливали мерным цилиндром 10 см1 раствор "переносчика" и экстрагировали при периодическом встряхивании в течение 10 мин. Смеси давали отстояться, нижний (водный) слои сливали в пробирку. В водном слое определяли остаточное содержание АМГ методом ВЭЖХ,

Реэкстракция ионных ассоциатое АМГ с "переносчиком" растворами аммиака и натрия гидроксида

В делительную воронку емкостью 50 см3 пипеткой вносили 10 см3 экстракта АМГ, приливают мерным цилиндром 10 см раствор экстрагента и встряхивали в течение 10 мин. В делительную воронку к органической фазе приливали 10 см3 раствора аммиака или натрия гидроксида, включали мешалку и перемешивают в течение 10 мин. Режим перемешивания должен обеспечивать однородность смешения фаз. Смесь отстаивали в течение 10 мин, нижний слой (экстракт) сливали в пробирку, приливали в делительную воронку 10 см раствор аммиака и экстрагировали повторно. По окончании второй экстракции повторно отделяли органический слой, а водный раствор переносили в пробирку,

В водном слое определяли содержание АМГ методом ВЭЖХ.

Приготовление раствора красителя бромтимолового синего

В мерную колбу объемом 1000 см количественно переносили 0,468 г красителя БТС, приливали 10-20 см3 0,1 Н раствора гидроксида натрия, доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали до полного растворения красителя.

Изучение влияния значения рН раствора на экстракцию 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

Органические вещества-"переносчики" по своей химической природе являются кислотами, основаниями или их солями, поэтому в реакции ионного обмена (замещения ионов) они вступают при различных значениях рН растворов - в кислых или щелочных средах, образуя ионные ассоциаты. Наиболее полное извлечение вещества из водного раствора или связывание его в ионный ассоциат зависит от многих факторов и, прежде всего, от способности реагируем ых компонентов вступать в реакции ионного обмена (способности к диссоциации). Реакционная способность при этом обуславливается наличием или отсутствием у них ионизированных групп.

Выбор наиболее оптимального значения рН раствора подразумевает создание таких условий, при которых у реагирующих веществ ионизировано наибольшее число ионогенных группировок. В этом случае в реакции ионного обмена участвует максимальное количество реагирующих веществ.

Исследования по изучению влияния значения рН раствора на экстракцию АМГ проводились с водными растворами апрамицина, гентамицина и тобрамицина концентрацией 0,012 молз дм"3 и растворами переносчиков - ДБСН и СФН в насыщенном водой изобутаноле концентрацией "переносчика" 0,06 моль- да3, Значение рН растворов корректировали добавлением 20 %-го водного раствора H2SO4 или 5 %-го водного раствора NH4OH.

Сульфокислоты (ГШСК, ДБСН и СФН) являются сильными кислотами, и они ионизированы в широком интервале значений рН. Поэтому полнота связывания АМГ в ионный ассоциат будет определятся степенью протонизации аминогрупп антибиотика.

Выбранные "переносчики" в диссоциированном виде имеют заряд, равный единице [55-60]. Для более полного извлечения антибиотика из водной фазы необходимо, чтобы "переносчик" прореагировал как можно с большим числом аминогрупп АМГ (максимальное число аминогрупп в молекуле АМГ равняется 5). Поэтому предположительно, для наиболее полного экстракционного извлечения из водных растворов АМГ, необходим 5-кратный мольный избыток "переносчика". Данные литературы по экстракции алифатических аминов свидетельствуют о том, что необходимый избыток экстрагента зачастую удается подобрать только экспериментальным путем [70-73].

Исследования по изучению влияния мольного соотношения антибиотик-"переносчик" на полноту извлечения из водных растворов АМГ при экстракционном выделении проводили с водными растворами тобрамицина, концентрацией антибиотика 0,012 молв дм"3 при значениях рН=5,5-7,0. Экстракцию проводили растворами ПНСК, ДБСН и СФН в насыщенном водой изобутаноле с различными значениями концентраций. Результаты, полученные при изучении влияния количества переносчика на степень извлечения АМГ из водных растворов, представлены в таблице 8.

Из представленных в таблице 8 данных видно, что проведение экстракции АМГ при 5-кратном мольном избытке "переносчиков" не позволяет полностью извлекать антибиотик из раствора. Это объясняется, по-видимому, тем, что при таком соотношении не удается добиться максимально возможной гадрофобности ассоциатов, которая достигается при связывании всех аминогрупп в молекуле АМГ.

Похожие диссертации на Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах