Введение к работе
Актуальность темы. Ужесточение мер контроля качества продуктов питания, увеличение количества регулируемых в них токсикантов и одновременное снижение законодательно регулируемых максимально допустимых их количеств определяет актуальность разработки быстрых и простых в исполнении методик пробоподготовки образцов и определения в них загрязнителей. К одним из наиболее опасных классов токсикантов можно отнести полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), микотоксины и антибиотики различных классов. Применяемые в настоящее время методы определения токсикантов в продуктах питания в основном относятся к хроматографии, которую отличает длительность проведения единичного анализа и невозможность его проведения вне лаборатории.
Наиболее полно требованиям по чувствительности и специфичности отвечают иммунохимические методы анализа. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) отличает простота в исполнении, что позволяет использовать данный метод для разработки и оптимизации способов снижения матричного эффекта в сложных образцах (красное вино, пиво, молоко). Так как ПФИА не всегда обладает высокой чувствительностью по сравнению с другими иммунохимическими методами, его применяют для выбора оптимальных для работы антител, характеристики аффинности антител, а также для определения аналитов, установленные значения предельно допустимых концентраций (ПДК) на которые достаточно высоки (как, например, для антибиотиков в молоке).
Часто ситуация требует дать заключение о присутствии или отсутствии загрязнителя в образце хотя бы на качественном или полуколичественном уровне в течение короткого промежутка времени. Поэтому проводилась разработка колоночного иммунохимического тест-метода. Он позволяет отказаться от стадии предварительной пробоподготовки и достичь высокой чувствительности, объединив очистку образца, концентрирование и определение токсиканта. Этот метод дает возможность получить точный и быстрый ответ о присутствии/отсутствии определяемого соединения в анализируемом образце в концентрации, соответствующей установленному значению ПДК на данный аналит.
Цели и задачи исследования. Целью работы явилась разработка экспрессных иммунохимических методик для определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксинов и антибиотиков) в продуктах питания, характеризующихся как простыми матрицами (вода), так и сложными (красное вино, пиво, молоко). В качестве методов определения в работе применяли колоночный иммунохимический тест-метод и ПФИА. Особый акцент делали на разработке простого, надежного и быстрого способа пробоподготовки образца, хорошо сочетающегося с данным методом определения. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
осуществить синтез иммунореагентов: конъюгатов ПАУ (пирена, бензо[а]пирена), микотоксинов (охратоксина А и афлатоксина В1), антибиотиков (цефалексина, цефалотина и гентамицина) с флуоресцентными и ферментными метками, белками-носителями;
оптимизировать условия определения токсикантов в образцах, характеризующихся простыми матрицами, колоночным иммунохимическим тест-методом, что включает в себя
выбор оптимального носителя для иммобилизации антител и способа их иммобилизации, выбор оптимальных концентраций иммунореагентов;
предложить быстрый и простой в исполнении способ очистки образцов, характеризующихся сложными матрицами (пиво, красное вино, молоко) перед определением содержания в нем загрязнителей и разработать методики определения токсикантов в таких образцах на основе ПФИА;
разработать методики определения как индивидуальных загрязнителей, так и нескольких загрязнителей родственной и неродственной природы колоночным иммунохимическим тест-методом в образцах, характеризующихся сложными матрицами (красное вино, пищевые добавки);
предложить методику получения количественных результатов колоночным иммунохимическим тест-методом;
осуществить сравнение меток различной природы для детектирования аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе.
Научная новизна
Модернизирован колоночный иммунохимический тест-метод путем введения в колонку контрольного слоя, помещения в колонку нескольких детектирующих иммунослоев для определения нескольких аналитов родственной и неродственной природы.
Предложена методика простой и быстрой очистки красного вина и пива фильтрацией через колонки, наполненные твердофазным сорбентом, перед определением микотоксинов методом ПФИА.
Разработана методика очистки красного вина и определения в нем токсикантов колоночным иммунохимическим тест-методом путем пропускания образца через систему совмещенных очищающей и детектирующей колонок.
Впервые были разработаны методики ПФИА определения афлатоксина В1 в пиве, цефалексина и гентамицина в молоке.
Разработан количественный колоночный иммунохимический тест-метод при использовании портативного фотометра.
Проведено сравнение детектирующих меток различной природы (фермент пероксидаза хрена, наночастицы золота, Cd/Te квантовые точки) для использования в колоночном иммунохимическом тест-методе.
Практическая значимость работы
Разработан ряд иммунохимических методик для определения полиароматических углеводородов, микотоксинов и антибиотиков в образцах с различными матрицами.
Предложены быстрые и простые в исполнении методики очистки образцов перед определением токсикантов различными методами.
Иммунохимический колоночный тест-метод адаптирован для определения одного или нескольких токсикантов в образцах со сложными окрашенными матрицами и получения количественных результатов.
Проведено сравнение детектирующих меток в колоночном иммунохимическом тест-методе.
На защиту автор выносит
Разработку колоночного иммунохимического тест-метода для определения аналитов в образцах, характеризующихся простыми матрицами (на примере пирена и бензо[а]пирена в различных водных образцах).
Модифицирование колоночного иммунохимического тест-метода введением в него контрольного слоя.
Методики очистки образцов, характеризующихся сложными матрицами (красное вино, пиво), основанные на фильтрации образцов через колонки, наполненные сорбентом.
Методики ПФИА определения содержания афлатоксина В1 в пиве, антибиотиков (цефалексина, гентамицина) в молоке.
Методику очистки образцов со сложными окрашенными матрицами для определения как индивидуального соединения (охратоксина А), так и двух аналитов неродственной природы (охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола) в красном вине колоночным иммунохимическим тест-методом.
Результаты сравнения детектирующих меток для регистрации аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе.
Личный вклад автора заключается в анализе литературных данных по теме диссертационной работы, в разработке методик определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксинов, антибиотиков) в образцах, характеризующихся как простыми (вода), так и сложными окрашенными (красное вино, пиво, молоко) матрицами двумя иммунохимическими методами (колоночным иммунохимическим тест-методом и методом ПФИА), в развитии и модифицировании колоночного иммунохимического тест-метода, в обработке результатов и апробации методик для анализа реальных образцов. Постановка исследовательских задач, анализ полученных результатов и их обобщение, формулирование выводов проводились совместно с научным руководителем. В публикациях в соавторстве личный вклад соискателя состоит в экспериментальном выполнении как части работы, так и всей работы целиком, интерпретации и обработке полученных им результатов, написании статей.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: VI Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (2007 г., Саратов, Россия); Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008», «Ломоносов 2009», «Ломоносов 2010» (Москва, Россия); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы» (2008 г., Белгород, Россия); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (2008 г., Москва, Россия); Втором Съезде микологов России (2008 г., Москва, Россия); «41 International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA)» (2009 г., Prague, Czech Republic); Междисциплинарном микологическом форуме (2010 г., Москва, Россия); Международной конференции студентов и аспирантов фонда И.В. Березина (2010 г., Москва, Россия).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 18 работ, в том числе 5 статей в международных и отечественных журналах, 12 тезисов докладов международных и российских конференций. По материалам работы получен 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждение (3 главы), выводов, списка цитируемой литературы (291 источник), приложений и списка сокращений. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, содержит 56 рисунков и 47 таблиц.
Финансовая поддержка работы осуществлялась NATO Collaborative Linkage Grant "New strategy for biodetection of explosive nitrochemicals in environmental samples", совместных проектов DAAD и РФФИ (projects A/07/71207 и A/07/71208), Bijzonder Onderzoeksfonds (BOF) of the Ghent University (011D02803), Bilateral cooperation Flanders and Russia (01S04106), DAAD «Forschungskurzstipendium» стипендиальной программы, Федеральной целевой программой "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг." (государственный контракт 16.740.11.0158 от 2 сентября 2010 г.)
