Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Бешенство животных 12
1.1.1. Эпизоотическая обстановка по бешенству в РФ 15
1.1.2. Эпидемиологическая ситуация бешенства (гидрофобии) в Российской Федерации
1.2. .Возбудитель бешенства 17
1.2.1. ' Характеристика возбудителя 17
1.2.2. 'Морфология и химический состав 18
1.2.3. Устойчивость вируса 21
1.2.4. Культивирование вируса 21
1.3. Эпизоотология 22
1.4. Лабораторная диагностика 25
1.4.1. Методы обнаружения антигенов вируса бешенства 26
1.4.2. Методы выделения вируса бешенства 29
1.4.3. -Методы обнаружения генома вируса . 30
1.4.4. Обнаружение антирабических антител 31
1.5. Иммунитет, меры борьбы и специфическая профилактика 35
1.6. Заключение по обзору литературы 39
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ... 48
3.1. Отработка условий получения антигенов вируса бешенства для ИФА 48
3.2. Синтез протеин А-пероксидазного коньюгата 54
3.3. Получение контрольных сывороток для иммуноферментной тест-системы 55
3.4. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых кошек и собак 58
3.4.1. Отработка оптимальных условий постановки непрямого ИФА.. .58
3.4.2. Определение допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток.: 60
3.4.3. Определение аналитической чувствительности тест-системы непрямого ИФА 61
3.4.4. Определение аналитической специфичности тест-системы непрямого ИФА 62
3.5. Количественное определение антирабических антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых кошек и собак 63
3.5.2. Результаты количественного определения антител к вирусу бешенства и гликопротеину в непрямом ИФА 66
3.6. Применение разработанной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак : 69
3.6.1. Определение уровня антирабических антител в сывортках крови привитых против бешенства кошек и собак 69
3.6.2. Определение уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных коров 70
3.7. Исследование эффективности применения иммуноферментной тест-системы и РН для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак 71
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 73
5. ВЫВОДЫ 83
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 84
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
ПРИЛОЖЕНИЯ 99
- Бешенство животных
- СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Отработка условий получения антигенов вируса бешенства для ИФА
Введение к работе
Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями рабического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (собаки и кошки) [1,2,8,15,34].
В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев. Интенсивность распространения" бешенства домашних животных находится в прямой зависимости от; численности безнадзорных собак и кошек [8,28,31,36,57,61].
В 2000-2005гг в Российской Федерации увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%. Бешенство среди различных видов животных регистрировалось в 2007 году на территории 49 субъектов РФ.
Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика. Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популяционной и индивидуальной защиты животных [14,32].
Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейт-рализующих антител является фактором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции [15,119].
В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству, содержание в сыворотках крови привитых против бешенства живот ных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл, считается минимальным уровнем протективного антирабического иммунитета (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,2004) [120].
С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и содержание вируснейтрализующих антител в сыворотке крови не менее 0,5МЕ/мл (Регламент Совета и Европейского парла мента,2003). 4
Для определения антител в сыворотках крови к вирусу бешенства, ВОЗ рекомендует использовать реакцию нейтрализации in vivo РН на мышах и тесты in vitro на культуре клеток: тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN)[ 17,24,95,96,119,120].
Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса. Постановка РН на мышах трудоемка, длительна во времени (14-21 день), требует живого вируса и значительного количества мышей, что увеличивает • стоимость анализа.
В практике применяются традиционные методы определения антира-бических антител, такие как РИГА, РСК, РНИФ, РДП [24,26].
Для решения аналогичных задач предложены методы иммунофер-ментного анализа, основанные на использовании целого вируса бешенства, или и его оболочечного белка-гликопротеина (белок G), однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют количественно определять наличие антител против бешенства в сыворотках крови животных после вакцинации [3,10,26,35,45,66,79,113]. На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству, в качестве альтернативного, рекомендует метод непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения в сыворотке крови привитых кошек и собак антител к вирусу бешенства [96].
К преимуществам непрямого ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса бешенства штамм «CVS», референс-сыворотки с известным содержанием вирус-нейтрализующих антител и возможность в короткие сроки (3-4ч) по количественному содержанию антител в сыворотках крови вакцинированных животных определить уровень антирабического иммунитета.
С учетом этого, разработка тест-системы непрямого ИФА для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак, является актуальной задачей для практической ветеринарии.
Цель и задачи исследования Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы, на основе непрямого иммуноферментного анализа, для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и его компонента-гликопротеина для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.
2. Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.
3. Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы. 4. Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.
5. Исследовать эффективность применения разработанной иммунофер-ментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток.
7 Научная новизна работы.
Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:
Впервые в РФ разработана иммуноферментная /гест-система на основе непрямого ИФА с применением культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак
Отработаны условия очистки и концентрирования культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.
Подобрана схема иммунизации продуцентов для получения антира-бической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.
Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства ко шек и собак с помощью разработанной тест-системы и РЫ в культуре клеток.
г Практическая значимость работы. Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммунофермент-ная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий, позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител, и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.
Разработанная тест система может быть использована для определения антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак, при перевозе их через границу Российской Федерации.
Практические предложения Для практического использования предлагаются: Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных» утверждена директором ВНИТИБП 01.2006г.
«Методические указания по определению уровня антител у привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.
Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак». «Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».
НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008г).
Основные положения, выносимые на защиту.
Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.
Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток. :
Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.
Апробация работы и публикация результатов
Материалы исследований были доложены на заседаниях научного совета ГНУ ВНИТИБП. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария и кормление».
Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе материалы получены, проанализированы и обработаны автором самостоятельно. Практическую и консультативную помощь при исследовании сывороток крови кошек и собак в РН на культуре клеток оказал д.б.н., профессор Кузнецов Д.П., ведущий научный сотрудник ФГУ ВГНКИ к. б.н. Елаков А.Л.
Бешенство животных
Бешенство - особо опасная инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением центральной нервной системы, к которой восприимчивы домашние и дикие животные, а также человек [2,5]. Бешенство, по оценкам ВОЗ, входит в пятерку зоонозов, наносящих наибольших социально-экономический ущерб и является постоянной угрозой для жизни человека и животных [15,17,89].
Бешенство распространено практически по всему миру, за исключением некоторых островных государств (Великобритания, Ирландия, Новая Зеландия, Япония) и Антарктиды. По данным экспертов ВОЗ и МЭБ болезнь регистрируется более чем в ПО стран земного шара. Ежегодно погибает около 50 тысяч человек, из этого числа 35-45 тысяч (90%) приходится на Азиатский континент, в основном на Индию. Доля детской смертности составляет 30-50%, от числа заболевших [1,7,98]. В зависимости от резервуаров и особенностей течения, распространение бешенства можно отнести к нескольким ареалам:
Полярный ареал, включающий РФ, Чукотку, Гренландию, Аляску, где в 60 - 90% случаев резервуаром вируса бешенства служат песцы.
Центральная и Западная Европа, азиатская часть РФ, США, Мексика входят в зону, характеризующуюся многочисленными носителями бешенства: куницы, красные лисы, барсук, волки, грызуны, скунсы, енотно-видная собака [75,117].
Южная и Центральная Америка, где резервуарами являются летучие мыши-вампиры [62,94,97].
Африканский ареал, где основными носителями вируса являются собаки, шакалы, мангусты.
Распространено бешенство, главным образом, среди плотоядных животных как диких, так и домашних.
Из всего многообразия животного мира только 4 отряда хладнокровных животных не подвержены этой инфекции, которая, помимо диких животных, поражает домашних и сельскохозяйственных животных, а также человека [25,36,48,50].
За период 2000-2005 гг. среди животных было отмечено более 82 тыс. случаев бешенства, подтвержденных лабораторным анализом; погибло свыше 30 млн человек и более 10 млн. человек получили различные повреждения от животных и более 5 млн. человек специфическое антираби-ческое лечение [15,22].
Несмотря на все усилия санитарных властей, случаи заболевания среди людей все еще регистрируются в районах, где дикие животные служат резервуаром вируса бешенства [29,34]. Спектр патогенности ВБ тесно связан с его экологией и имеются 2 формы эпизоотии Б: городская и лесная, при которой возбудитель циркулирует среди диких плотоядных по типу природно-очаговой инфекции. Периодичность эпизоотии — характерная особенность Б, а сезонные подъемы заболеваемости Б среди животных тесно связаны с географией региона и биологическими циклами активности животных [75,90,121].
Лисицы обусловливают 60 - 85% от всех случаев заболевания бешенством среди диких животных. Их роль в эпизоотологии бешенства объясняется чрезвычайной восприимчивостью к ВБ, увеличением популяции этих животных, а также возможностью перорального заражения[ 19,29,47]. Увеличению численности лисиц способствует истребление их естественных врагов - волков, рысей, медведей, орлов и других хищников, а также увеличение количества грызунов - основного источника корма для лисиц[69,70]. У 40-89% лисиц болезнь часто протекает хронически и латентно, обеспечивая длительную персистенцию вируса в естественных условиях 6,65].
Собственные исследования
Работа выполнена в 2005-2008гг в отделе иммунологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской Академии сельскохозяйственных наук.
Вирус бешенства. В работе использовали тест-штамм фиксированного вируса бешенства «CVS» (мозговой), полученный из ВГНКИ в 2001году. Вируссодержащую суспензию адаптированного к культуре клеток ВНК-21 фиксированного nrraMMa«CVS» получали из НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского. Вирус прошел 5-6 пассажей и максимальные титры вируса достигали на 5-6 сутки после заражения и составляли 5,0 lg ТЦД 5о/см. Электронно-микроскопическое изучение вируса бешенства проводили с помощью негативного контрастирования. Плавучую плотность, вируса бешенства определяли дифференциальным центрифугированием в градиенте 10-60% сахарозы (НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского). Титрование инфекционности вируса бешенства проводили путем ин-трацеребрального заражения мышей, согласно ГОСТ 26075-84[17].
Антигены для ИФЛ. Для получения препарата цельновирионного вируса бешенства, вируссодержащую суспензию очищали от грубых частиц (клеточного детрита) центрифугированием в течение 20 мин при 1тыс. g. Надосадок вновь подвергали ультацентрифугированию при 50Tbic.g в течение 60 мин и получали концентрированнный, освобожденный от белков культуральной жидкости, вирус бешенства.
Для максимального удаления примесных белков, концентрированный препарат вируса доочищали гель-хроматографией на сефарозе 4В в трис-НС1 буфере рН 8,0. Материал первого пика, снятого с сефарозы 4В, объединяли, концентрировали центрифугированием при 50Tbic.g в течение мин., растворяли в 1/10 объема и исследовали в серологических реакциях.
Гликопротеин (ГП) получали растворением мембран очищенного вируса бешенства тритоном Х-100 в 1-2% концентрации и отделяли от оставшегося вируса бешенства и белков нуклеокапсидного комплекса, центрифугированием при 50 тыс. g в течение 60 мин. Надосадок, после ультрацентрифугирования, диализовали против 1% лизина и использовали в качестве антигена для ИФА. Осадок растворяли в 1/20 исходного объема и методом гель-хроматографии на сефадексе G-75 в трис-HCl буфере рН 7,8 с 0,5М NaCL отделяли вирус бешенства. Материал первого пика после хроматографии представлял собой цельный вирус бешенства, второго пика - фракцию нуклеокапсидного комплекса.
Состав вирусных белков исследовали с помощью ДСН-ПААГ электо-рофореза в 12% полиакриламидном геле (Laemmli U. К. 1970.), мол. массу вирусных белков - с помощью хроматографии на сефадексе G-200. В качестве маркеров использовали коммерческий набор маркеров мол. массы («Sigma»).
Прямой ИФА. Специфичность фракций гликопротеина и нуклеокапсидного комплекса подтверждали прямым ИФА. Для этого очищеный цельный вирус бешенства, гликопротеин и нуклеокапсидный комплекс сорбировали в лунки 96-луночных микроплат в концентрации 4-10 мкг/мл в 20 мМ карбонатном буфере рН 9,6 в течение 18ч при 4С, промывали и неспецифическую адсорбцию блокировали 1% альбумином КРС в течение 1ч при 37С.После промывки планшет, в лунки вносили пероксидазные коньюгаты мышиных моноклональных антител к гликопротеину и нук-леокапсидному комплексу вируса бешенства в рабочих разведениях 1:5000 и 1:2500 (НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского) и инкубировали 1 ч при 37 С. Проявление и учет реакции прямого ИФА проводили аналогично непрямого варианта ИФА.
Отработка условий получения антигенов вируса бешенства для ИФА
Для наработки вируса бешенства использовали тест-штамм фиксированного мозгового вируса бешенства «CVS» ( получен из ВГНКИ). Вируссодержащую суспензию адаптированного к культуре клеток ВНК-21 фиксированного штамма «CVS» получали из НИИ им Д.И.Ивановского. Вирус прошел 5-6 пассажей, максимальные титры вируса достигали на 5-6 сутки после заражения и составляли 5,0 lg ТЦД 5о/см.
Получение очищенного вируса бешенства. С целью получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» для ИФА были испытаны ряд методов, позволяющих максимально освободиться от белков клеточной культуры с сохранением целостности вирусных частиц, таких как ступенчатое центрифугирование и доочиска гель-хроматографией на сефарозе 4В.
Ультрацентрифугирование надосадка после центрифугирования культуральной вируссодержащей жидкости при 1 Tbicg и 50 Tbic.g на центрифуге VAC-60 в течение 60 мин позволило получить частично очищенный вирус с концентрацией белка 35 мкг/мл и титром инфекционности 5,5 ТЦДзо/см-От остаточных примесных белков освобождались гель-хроматографией на сефарозе 4В.
Элюционный профиль хроматографии вируса на сефарозе 4В в ЮмМ трис-HCI буфере, содержащем 0,5 М NaCI, 0,01 М ЭДТА рН 8,0 был представлен 2 пиками. Исследованием материала двух пиков в РСК и РН на мышах было установлено, что комплементсвязывающая активность была обнаружена в обеих пиках в тирах 1:20 и 1: 80, инфекционностью обладал только материал первого пика.
Электронная микроскопия этих фракций показала, что фиксированный вирус бешенства, адаптированный в культуре клеток ВНК-21, представляет собой вытянутые пулеобразные формы (50-80 X 100-200 нм) с характерными выступами на наружной оболочке (рис. 1).
По данным электронной микроскопии, концентрированный материал первого пика с содержанием белка 55мкг/мл и титром инфекционности 5,8 lg LD50/CM содержал большое количество полиморфных частиц размером 190-210 нм с характерными выступами на наружной оболочке, типичными для вируса бешенства.
Дифференциальным центрифугированием на градиенте 10-60% сахарозы получен график распределения зон плотности, в котором пики ин-фекционой активности совпадают с пиками гемагглютинирующей активности и плавучей плотности на градиенте сахарозы, которая составила 1,15-1,16 г/см3 (рис.2).
Рис.2. Плавучая плотность культурального вируса бешенства на градиенте сахарозы.
Таким образом, выявленный один пик инфекционности свидетельствует о наличии высокоочищенного препарата вируса бешенства.
Инактивация очищенного вируса бешенства Р-пропиолактоном 1:4000 при 4С в течение 4 часов обеспечивала потерю инфекционной активности с сохранением гемагглютинирующей и нейтрализующей активности.
Антигенные свойства очищенного вируса изучали в реакциях РСК, РИГА, РДП и ИФА с антирабическими сыворотками баранов. Установлено, что очищенный вирус выявлял антирабические антитела во всех реакциях, но максимальная серологическая активность его установлена в ИФА. Очищенный вирус был использован в качестве антигена для постановки иммуноферментной тест-системы по определению антител в сыворотках крови привитых против бешенства животных, получения антирабиче-ских сывороток и выделения гликопротеина.
Получение гликопротеина вируса бешенства. Из большого выбора реагентов, пригодных для солюбилизации мембранных белков, нами был выбран неионный детергент тритон Х-100, обладающий способностью дезен-тегрировать мембраны и удерживать белки в растворенном состоянии, не нарушая их антигенной структуры, и не препятствуя взаимодействию с антителами.
