Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.
Перевод животноводства на промышленную основу наряду с большими техническими и экономическими преимуществами имеет ряд недостатков, таких как создание благоприятной ситуации для массового распространения инфекционных заболеваний. В их числе и так называемые «малые» респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота. Они вызываются как самостоятельно, так и в различных сочетаниях вирусами парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринот-рахеита (ИРТ), вирусной диареи (ВД), аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), нанося огромный экономический ущерб животноводству. Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии еще и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики вирусных болезней крупного рогатого скота.
Одним из этиологических агентов, вызывающих вспышки острых респираторных заболеваний у крупного рогатого скота, овец и коз различного возраста является респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), представитель семейства па-рамиксовирусов, рода пневмовирусов.
Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота контагиозная болезнь, клинически проявляющаяся повышением температуры, снижением аппетита, затрудненным дыханием, одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем.
PC - инфекция не вызывает большого отхода животных, но тяжелое и длительное течение с осложнениями приводит к потере продуктивности, вынужденному убою крупного рогатого скота, нанося тем самым значительный экономический ущерб животноводству.
Однако, в отличие от других вирусных респираторных инфекций, распространение и наносимый экономический ущерб этим заболеванием остаются изученными недостаточно, что связано со сложностью выделения и культивирования РС-вируса.
Это в свою очередь затрудняет получение в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью вирусного сырья, для диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
В настоящее время PC - инфекция крупного рогатого скота зарегистрирована во многих странах мира: Бельгии, Японии, Англии, США, Нидерландах, Венгрии, Чехии, Словакии, ,Болгарии, в том числе и с 1975года в России (Халенев ГА., Гуненков В. В.)
С 1977г. биологической промышленностью выпускается набор сухих диаг-ностикумов для диагностики PC-инфекции крупного рогатого скота, разработчиками которого являются Гуненков В.В., Халенев ГА. Набор применяют для обнаружения вирусного антигена в патматериале методом иммунофлуоресценции (ИФ), выделения вируса и его идентификация в реакциях ИФ, связывания комплемента (РСК) и диффузной преципитации (РДП), а также для выявления специфических антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РДП. Однако его применение было очень ограничено, из-за трудностей интерпретации полученных данных. Ранее этот диагностический набор сыграл большую роль в диагностике PC-инфекции крупного рогатого скота в нашей стране, его применение позволило установить наличие инфекции.
При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов, метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода
обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.
Быстрый и точный диагноз PC-инфекции крупного рогатого скота является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.
1.2. Целии задачи исследования.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе аффинно-очищенных и концентрированных антигенов РС-вируса КРС, штамм «Randall», для использования их в качестве компонента набора для определения уровня антител в крови больных, переболевших и вакцинированных животных в иммуноферментном анализе.
Решались следующиезадачи:
1.2.1. Сравнить условия репродукции PC-вируса, штамм «Randall», в первично-
трипсинизированной культуре клеток почки (ПЭК), легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы и перевиваемых линий ПТ-80 и Тауэр;
1.2.2. Разработать метод получения очищенного и концентрированного антигена
PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток.
Выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG КРС антитела и синтезировать анти-IgG КРС иммунопе-роксидазный коньюгат.
Выделить белки PC-вируса, штамм «Randall», иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN сефарозу.
На полученном сорбенте вьщелить специфические к антигенам РС-вируса антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN сефарозу.
Разработать компоненты набора для определения уровня антител к РС-вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе на основе аффинно-очищеных антигенов РС-вируса.
Исследовать воспроизводимость результатов по определению уровня антител к PC-вирусу КРС, полученных с использованием разработанного имму-ноферментного набора;
Провести сравнительную оценку чувствительности и специфичности РН, РИГА и разработанного иммуноферментного Набора при определении уровня анти-РСВ антител в крови больного, переболевшего и вакцинированного крупного рогатого скота.
1.3. Научнаяновизна.
В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения очищенных и концентрированных антигенов PC-вируса, репродуцированного в культуре клеток, с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-РСВ igG Сефарозе.
При изучении в электрофорезе белков PC-вируса, штамм «Randall», которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, выявлено 9 структурных глико-протеинов с молекулярной массой от 28 до 180 кД.
По результатам иммуноблотинга показано, что 6 белков PC-вируса, которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-РСВ антител в организме восприичивых животных.
разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к PC-вирусу крупного рогатого скота на основе аффинно очищеных антигенов PC-вируса, штамм «Randall».
1.4. Практическая значимость работы.
Результаты проведенных исследований позволили разработать временную инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммунофер-ментном анализе и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-РСВ антител в сыворотках крови КРС.
Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.
1.5. Апробацияработы.
Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 - 2004г.г.), на международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов», Щелково (2004 г).
По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
1.6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены
на 143 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: вве
дение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследо
ваний, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список ли
тературы, содержащий 69 отечественных и 167 зарубежных источников и прило
жение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты от
дельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация ил
люстрирована 15 таблицами, 22 рисунками и 1 схемой.
Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, профессору А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.
