Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии, в частности широко применяемый метод клонального микроразмножения, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество растений при недостатке исходного материала, а также получать потомство, генетически идентичное исходному виду или форме. Стратегия сохранения биоразнообразия отражена в различных нормативных документах, таких как «Национальная стратегия по сохранению биоразнообразия России» (2001) и «Стратегия ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений» (2003). Задачами этих программ являются: формирование единого банка данных; инвентаризация редких видов и разработка системы критериев для их выявления и определения уровня их охраны; изучение биологических особенностей редких видов и механизмов действия на них лимитирующих факторов; разработка биологических принципов и способов сохранения редких видов; разработка единых методик работы с редкими и исчезающими видами растений при проведении популяционных исследований, интродукции и культивирования in vitro.
К редким растениям относятся, например, диоскорея ниппонская, диоскорея кавказская, бересклет карликовый, а также кирказон манчьжурский, которые занесены в Красную Книгу РФ. Кроме того, диоскорея является ценной лекарственной культурой, богатой биологически активными веществами, в частности, диосгенином, который накапливается в различных тканях и органах этих растений, и обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость растений к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды и др. Данные культурные растения являются богатством России, которое необходимо сохранять для будущих поколений. Поэтому разработка методологических подходов по сохранению изучаемых видов растений является актуальной проблемой.
Цели и задачи исследования. Целью работы - оптимизация условий культивирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Kom. и разработка технологии их клонального микроразмножения.
Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи: отработать методику по получению хорошо растущей стерильной культуры изолированных эксплантов Euonymus nana и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis;
оптимизировать состав питательной среды для культирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus nana и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis;
изучить влияние нетрадиционных регуляторов роста Дропп и Цитодеф, а также препарата Мицефит на морфогенетическую активность изолированных эксплантов;
изучить влияние условий культивирования на суммарное содержание растворимых фенольных соединений в разных типах пересадочной культуры;
изучить локализацию фенольных соединений в тканях растений in vivo и in vitro.
Научная новизна работы. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонскои и кирказона маньчжурского. Впервые установлены особенности размножения в условиях in vitro исследуемых видов, занесенных в Красную книгу РФ.
Показано, что для бересклета карликового и кирказона маньчжурского размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем, а для диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской - за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов и в пазухе листа.
Впервые изучено влияние нетрадиционных для культуры in vitro регуляторов роста Дропп, Цитодеф и Мицефит на морфогенетическую активность изолированных органов и пересадочной культуры изучаемых видов. Установлено, что присутствие в составе питательной среды препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов или микроклубней, и увеличивало коэффициент размножения. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации 10-6 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядка, а также активизировался процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.
Впервые на растениях диоскореи ниппонской и кавказской, бересклета карликового и кирказона маньчжурского изучено содержание растворимых фенольных соединений и их локализация в тканях интактных растений, микроклонах и каллусной культуре. Установлены особенности их накопления в зависимости от первичного экспланта и условий культивирования.
Практическая значимость работы. Усовершенствованные технологии клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской могут быть применены для сохранения и создания коллекции in vitro данных видов. Для ускорения процесса размножения in vitro редких, лекарственных и исчезающих растений рекомендуется применять препарат Мицефит в концентрации 10-6 мг/л.
Результаты диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Сельскохозяйственная биотехнология», «Основы биотехнологии», «Прикладная биотехнология» для студентов агрономических специальностей.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
-
-
Особенности размножения в условиях in vitro Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Kom.
-
Эффективность применения препаратов Дропп, Цитодеф и Мицефит при клональном микроразмножении изучаемых видов
-
Закономерности в синтезе растворимых фенольных соединений и их локализация в тканях интактных растений, микроклонах и каллусной ткани.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: 11-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА (Москва. 2011); II Международной школе-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2011); Международной научной конференции молодых ученых РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012); Юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси» (Минск, 2012); Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012).
Личный вклад автора. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены лично автором на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Автор принимал непосредственное участие в разработке программы исследований, планировании и проведении экспериментов по изучению особенностей клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонской и кирказона маньчжурского in vitro. Результаты диссертационной работы обобщены совместно с научным руководителем, д.б.н. Е.А. Калашниковой. Соискателем лично написан литературный обзор и оформлена диссертационная работа.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 2 в журналах из списка ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов и библиографического списка. Общий объем рукописи 135 стр., содержит 15 таблиц, 52 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 203 источника, в том числе 135 на иностранных языках.
Похожие диссертации на Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.)
-
