Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 5
1.1. Общая характеристика представителей сем. Aristolochiaceae 5
1.1.1. Филогенетические взаимоотношения внутри сем. Aristolochiaceae 5
1.1.2. Особенности репродуктивной биологии представителей сем. Aristolochiaceae. 9
1.1.3. Биология опыления, завязывание семян 11
1.2. Кирказон маньчжурский Aristolochia manshuriensis Кот. (Hocquartia manshuriensis) как объект исследования 13
1.3. Генетическая изменчивость растений * 25
1.3.1. Генетический полиморфизм природных популяций и методы его исследования 25
1.3.2. Факторы, влияющие на уровень генетической изменчивости растений 30
1.3.3. Подразделенность и дифференциация природных популяций 34
1.3.4. Процессы в малых и изолированных популяциях растений 37
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.2. Методы 49
2.2.1. Изучение биологии размножения '49
2.2.1.1. Цитологическое изучение репродуктивных органов 49
2.2.1.2. Исследование динамики цветения и плодообразования 50
2.2.2. Анализ изоферментов 51
2.3. Статистическая обработка результатов 54
Глава 3. Репродуктивная биология Aristolochia manshuriensis 59
3.1. Способность к вегетативному размножению 59
3.2. Морфологическое и анатомическое строение репродуктивных органов 61
3.3. Биология цветения, плодообразование 70
Глава 4. Аллозимный полиморфизм популяций A. manshuriensis 81
4.1. Описание ферментных систем 81
4.2. Генетическая структура и изменчивость популяций A. manshuriensis 89
4.3. Подразделенность и дифференциация популяций A. manshuriensis 104
Заключение 115
Выводы 116
Литература 118
- Общая характеристика представителей сем. Aristolochiaceae
- Кирказон маньчжурский Aristolochia manshuriensis Кот. (Hocquartia manshuriensis) как объект исследования
- Цитологическое изучение репродуктивных органов
- Морфологическое и анатомическое строение репродуктивных органов
Введение к работе
Реликтовые виды растений являются свидетелями уникальных процессов, связанных с глобальными изменениями климата и преобразованиями континентов. Дальний Восток России перенёс сильное плейстоценовое похолодание, оставаясь свободным от сплошного ледяного покрова, и поэтому сохранил многие виды растений, происхождение которых относится к более ранним эпохам (Куренцова, 1968; Крестов, Верхолат, 2003). Эти сохранившиеся, преимущественно теплолюбивые, виды, в современных климатических условиях, как правило, имеют небольшую численность и сильно фрагментированные ареалы. Состояние популяций таких видов часто ухудшается под влиянием антропогенне го воздействия, что приводит к дальнейшему сокращению размеров популяций (Saunders et al., 1991). Как следствие, наблюдаются снижение генетического разнообразия и усиление негативных последствий генетического дрейфа и инбридинга, что может привести к полному исчезновению вида (Levin, 1988; Ellstrand, Elam, 1993). Многие виды растений Дальнего Востока России, обычные еще в начале XX века, стали редкими и исчезающими, при этом причиной их перехода в эту категорию было усиление влияния антропогенного фактора (Харкевич, Качура, 1981).
К числу таких редких и исчезающих видов относится эндемик Маньчжурского флористического района кирказон маньчжурский (Aristolochia manshuriensis Кот.) (Куренцова, 1968), занесенный в Красную книгу РСФСР (1988). Это реликтовая древесная лиана с ограниченным и фрагментированным ареалом (Слизик, 1978). Кирказон маньчжурский используют в качестве кардиотропного средства (Растительные ресурсы России..., 1996; Bulgakov et al., 1996). Природные популяции A. manshuriensis находятся в угнетенном состоянии, самовозобновление вида незначительное (Слизик, 1978). Г.Э. Куренцова (1968) охарактеризовала вид как регрессирующий. В настоящее время проблема сохранения и восстановления природных популяций кирказона маньчжурского стоит очень остро, особенно в связи с неконтролируемым сбором лианы на лекарственное сырье. Решение этой проблемы позволит сохранить не только уникальный компонент природных биотопов, но и ценный лекарственный ресурс, которым является A. manshuriensis.
Необходимым предварительным условием разработки стратегии сохранения редких видов является изучение состояния их генофонда и выяснение биологических особенностей, связанных с системой размножения.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении биологии размножения и популяционно-генетической структуры редкого лекарственного вида кирказона маньчжурского.
Были поставлены следующие задачи:
Исследовать особенности строения репродуктивных органов и биологии опыления у A. manshuriensis; выявить возможные причины низкого самовозобновления популяции, связанные с системой размножения.
На основе анализа изоферментов подобрать маркеры для изучения генетической изменчивости в природных популяциях A. manshuriensis.
Определить основные параметры генетической изменчивости и охарактеризовать популяционно-генетическую структуру A. manshuriensis на российской части ареала.
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного интитута ДВО РАН под руководством академика РАН Ю.Н. Журавлева и к.б.н. ст.н.с. О.Г. Корень, в рамках плановой тематики лаборатории. Работа была поддержана молодежными грантами ДВО РАН "Изучение генетической изменчивости и особенностей размножения редкого лекарственного растения кирказона маньчжурского" (2001 г.), "Изучение биологии размножения редких растений Дальнего Востока" (2004 г.), "Исследование генетического полиморфизма редких видов растений Дальнего Востока" (2005 г.).
Основные результаты работы получены автором лично.
Автор выражает глубокую благодарность своим руководителям - к.б.н. О.Г. Корень и академику РАН Ю.Н. Журавлеву (БПИ ДВО РАН), а также С.Ф. Васюкевич (ТИГ ДВО РАН) и А.Г. Васюкевичу (БПИ ДВО РАН) - за предоставленную возможность проведения экспериментов в условиях частной коллекции, к.б.н. B.C. Сидоренко (БПИ ДВО РАН) - за определение видов насекомых и консультации, к.б.н. СВ. Нестеровой - за содействие в проведении экспериментов в БСИ ДВО РАН и ценные советы, д.б.н., проф. В.В. Потенко (ГГМУ, Гомель), чл.-корр. РАН Т.Б. Батыгиной, к.б.н. Г.Е. Титовой, к.б.н. Е.А. Брагиной (БИН им. В.Я. Комарова РАН, Санкт-Петербург) - за консультации в работе; к.б.н. А.Б. Холиной, к.б.н. Т.Ю. Горпенченко и к.б.н. Е.М. Саенко (БПИ ДВО РАН) - за советы при подготовке рукописи и моральную поддержку.
Общая характеристика представителей сем. Aristolochiaceae
Систематическое положение
На протяжении многих лет таксономическое положение сем. кирказоновых (Aristolochiaceae Juss.), к которому относят кирказон маньчжурский (Aristolochia manshuriensis Кот.), является предметом споров. Е. Варминг в 1893 г. поместил сем. Aristolochiaceae в пор. Hysterophyta, подкл. раздельнолепестные (Chloripetalae). R. Wettstein (1935) отнес сем. Aristolochiaceae вместе с семействами Rafflesiaceae и Hydnoraceae к пор. многоплодниковые (Policarpicae) (подкл. Choripetalae). В большинстве работ отечественных ученых сем. Aristolochiaceae помещено в пор. аристолохиецветные (Aristolochiales Lindl.) (Комаров, 1903; Иванова, 1936; Рубцов, Шипчинский, 1951; Ворошилов, 1966, 1982; Харкевич, 1987; Черепанов, 1995), подкл. магнолиевые (Magnoliidae) (Тахтаджян, 1987; Cronquist, 1981). Во многих зарубежных работах сем. Aristolochiaceae относят к пор. Piperales (Gonzalez et al., 2001; Nickrent et al., 2002; Zanis et al., 2003).
Существуют три точки зрения о филогенетическом родстве сем. Aristolochiaceae. Так, согласно одной из них, виды сем. кирказоновых тесно связаны с представителями пор. Magnoliales (Cronquist, 1981; Dahlgren, 1983; Leins, Erbar, 1995; Takhtajan, 1996). Х.Я. Гоби (1916) выводит сем. Aristolochiaceae непосредственно от видов пор. Magnoliales, такого же мнения придерживается R. Wettstein (1935). В подтверждение этой версии приводятся аналогичность в строении вегетативных органов, цветка, оболочки микроспор и семени (Тахтаджян, 1987), сходство сетчатых элементов пластид П-типа (Behnke, 1988,1991), клеток с эфирными маслами, алкалоидов. На близость представителей сем. Aristolochiaceae к видам пор. Magnoliales указывают также данные по эмбриологии (Cocucci, 1983) и кариологии (Morawetz, 1985).
В соответствии со второй точкой зрения, наиболее близкими видами к представителям сем. Aristolochiaceae являются виды пор. Rafflesiales (Baldacci, 1894; Endress, 1990; Kubitrki, 1993). Такое мнение основано на сходстве цветочных структур, отличающихся простотой, наличием мясистого околоцветника, экстрозно раскрывающихся тычинок, слившихся в гиностемий пыльников, столбика и рыльца гинецея, а также присутствии нижней завязи с многочисленными семязачатками.
Наконец, ряд исследователей (Donoghue, Doyle, 1989; Loconte, Stevenson, 1991; Tucker, Douglas, 1996; Nandi et al., 1998) полагают, что виды сем. Aristolochiaceae тесно связаны с так называемыми "древними травами" (paleoherbs) (сем. Lactoridaceae и однодольные), от которых, предположительно, произошли представители сем. кирказоновых. Родство между сем. Aristolochiaceae и Lactoridaceae предполагали R.T.M. Dahlgren и Н.Т. Bremer (1985). Несмотря на то, что представители этих групп сильно различаются по эмбриологическим, кариологическим и палинологическим характеристикам (Lammers et al., 1986; Loconte, Stevenson, 1991; Tobe et al., 1993; Tucker, Douglas, 1996), эта гипотеза была подкреплена данными анализа морфологических признаков (Donoghue, Doyle, 1989; Loconte, Stevenson, 1991), анатомии стебля (Carlquist, 1993), а также молекулярными данными (Qiu et al., 1999; Soltis et al., 1997, 1999; Doyle, Endress, 2000; Nickrent et al., 2002; Zanis et al., 2003). Близкие родственные связи между видами сем. Aristolochiaceae и представителями класса однодольных предполагают многие авторы (Suessenguth, 1921; Huber, 1985; Dahlgren, Bremer, 1985; Behnke, 1991; Loconte, Stevenson, 1991; Leins, Erbar, 1995; Stevenson, Loconte, 1995; Gonzalez, Rudall, 2001; Kelly, Gonszalez, 2003), указывая на сходство адаксиальных профилей, трехчленность цветка, однобороздность или безапертурность пыльцевых зерен. Близость сем. Aristolochiaceae к однодольным была также обнаружена при анализе последовательности 18S рибосомальной ДНК (Bharathan, Zimmer, 1995).
Существуют и другие мнения относительно происхождения кирказоновых. Так, Н. Hallier (1912) выводит пор. Aristolochiales от сем. Lardizabalaceae, a J. Hutchinson (1959) -от пор. Berberidales (через Menispermaceae). Но так как у представителей сем. Lardizabalaceae, Berberidaceae, Menispermaceae оболочка пыльцевых зерен 3-бороздная или производная от 3-бороздного типа и никогда не бывает однобороздной, то возможность происхождения видов пор. Aristolochiales от этих семейств, по мнению А.Л. Тахтаджяна (1987), исключается.
В литературе также нет единого мнения относительно взаимоотношений родов внутри семейства. В соответствии с разными системами, сем. Aristolochiaceae подразделяется на 2-3 подсемейства и пять триб. P. Duchartre (1864), F.C. Hoehne (1927) и М.Р. Gregory (19J6) признают три подсемейства: Asaroideae (роды: Asarum L., Saruma Oliv., имеющие, как правило, актиноморфные цветки и полушаровидную завязь), Bragantioideae (род Thottea Rottb. с актиноморфными цветками и продолговатой завязью) и Aristolochioideae (роды: Aristolochia L., Holostylis Duch., Euglypha Chod. & Hassl., имеющие зигоморфные цветки). M. Gregory (1956) в результате цитогенетического исследования предложила следующую схему филогенетических связей родов: от предполагаемой предковой формы отходят три ветви, соответствующие трем подсемействам Asaroideae, Bragantioideae, Aristolochioideae. Первая ветвь, наиболее близкая к исходной форме, ведет к монотипному роду Saruma, г от него непосредственно - к роду Asarum, остальные две ветви (Bragantioideae и Aristolochioideae) отходят от гипотетической предковой формы независимо от линии Saruma -Asarum.
F. Klotzsch (1859), O.C. Schmidt (1935) и F.C. Hoehne (1942) выделяют два подсемейства: Asaroideae (роды: Saruma, Asarum, Thottea) и Aristolochioideae (роды: Aristolochia, Holostylis, и Euglypha), сходного мнения придерживается H. Huber (1993). На основе кладистического анализа морфологических признаков (Gonzalez, Stevenson, 2002; Kelly, Gonszalez, 2003) и молекулярных данных (Neinhuis et al., 2000) авторы также выделяют два подсемейства - Asaroideae и Aristolochioideae.
В соответствии с классификацией Н. Huber (1985) и А.Л. Тахтаджяна (1987), сем. Aristolochiaceae включает 12 родов и около 500 видов. O.C. Schmidt (1935) в подсем. Asaroideae включает роды Saruma и Asarum, а другое подсем. Aristolochioideae содержит две трибы: Bragantieae Klotzsch (роды: Asiphonia Griff, Thottea) и Aristolochieae (подтриба Isotrematinae H. Huber: роды - Isotrema Raf., Endodeca Raf.; подтриба Aristolochiinae H. Huber: роды - Parasitolochia Hutch. & Dalz., Howardia Klotzsch, Einomeia Raf, Euglypha, Holostylis, Aristolochia).
Представители сем. Aristolochiaceae разнообразны по жизненным формам и широко распространены по земному шару. Монотипный род трав Saruma из южной и центральной частей Китая традиционно считается наиболее примитивным в семействе (Thome, 1974; Cronquist, 1981). Род Asarum содержит около 100 видов вьющихся кустарников и многолетних трав, распространенных в Евразии и Северной Америке (Flowering plants..., 1971). Род Thottea насчитывает 28 видов кустарников и клубневых трав (Нои, 1984), большая часть которых является редкими и эндемичными растениями, занимающими территорию к юго-востоку от Индии, Малайзию и Филиппины (Gregory, 1956). Виды рода Isotrema представлены кустарниками и полукустарниками. Род Endodeca включает два вида трав. Род Parasitolochia включает 18 видов древесных лиан, распространенных в западной Африке (за исключением одного вида в Малайзии) (Jin-shuang, 1989).
Кирказон маньчжурский Aristolochia manshuriensis Кот. (Hocquartia manshuriensis) как объект исследования
У покрытосеменных разнообразные механизмы опыления развиты для единственной цели - перенос пыльцы с одного растения на рыльце пестика другого растения. У многих видов в процессе перекрестного опыления важную роль играют опылители (Гринфельд, 1978; Burger, 1981; Фергли, Пэйл, 1982).
В литературе встречаются данные об опылении некоторых представителей сем. Aristolochiaceae (Cammerloher, 1923; Petch, 1924; John, Bhatnagar, 1955; Daumann, 1959; Costa, Hime, 1983; Hou, 1983, 1984; Wolda, Sabrosky, 1986; Sakai, 2002). Перенос пыльцы на рьшьце пестика с помощью насекомых, по-видимому, является обычным для представителей рода Aristolochia, их цветки хорошо приспособлены для удержания насекомых (Johri, Bhatnagar, 1955). Фактически, они представляют собой великолепную ловушку: отгиб околоцветника соединен с мешочком посредством прямой воронковидной, слегка или U-образного изогнутой узкой трубки. Трубка околоцветника часто с "сигнальной" дорожкой и вздутой частью (мешочком). В верхушечной части мешочка стенка некоторых видов полупрозрачная и формирует "окошко" для пропускания света. Внутри трубки обычно находятся волоски или сосочки (Нои, 1983). Одиночные 4-5 клеточные волоски богаты цитоплазмой и наклонены преимущественно только в одном направлении пути (Petch, 1924; Johri, Bhatnagar, 1955; Hou, 1984; Wolda, Sabrosky, 1986). Эти волоски позволяют насекомым забраться внутрь цветка, но препятствуют их выходу. Когда тычинки раскрываются, пыльца падает на поверхность камеры, образованной при вздутии околоцветника (Johri, Bhatnagar, 1955), одновременно клетки волосков теряют тургор и больше не удерживают "затворников". Насекомые контактируют с раскрывающимися тычинками, обсыпаются пыльцевыми зернами и покидают цветок с грузом пыльцы. Впоследствии они могут посетить другие цветки, осуществляя перекрестное опыление (Cammerloher, 1923; Johri, Bhatnagar, 1955; Pfeiffer, I960; Daumann, 1971; Hou, 1983; Sakai, 2002).
Насекомые, главным образом мухи, иногда муравьи, привлекаются запахом гниения или падали, орехов, грибов и т.д. (Daumann, 1971; Brantjes, 1980; Hou, 1983, 1984). Иногда запах у представителей семейства появляется во время тычиночной фазы, его производят железы цветка или цветоножки (Sakai, 2002). Насекомое, попадая в цветок, питается нектаром и другими пищевыми субстанциями железистых волосков или секретом рыльца (Cammerloher, 1923; Petch, 1924; Daumann, 1959; Costa, Hime, 1983; Wolda, Sabrosky, 1986; Sakai, 2002).
Все виды Aristolochia, изученные до настоящего времени, опыляются мухами из разных семейств, включая Anthomiidae, Chloropidae, Milichiidae, Phoridae, Sarcophagidae и Syrphidae (Cammerloher, 1923; Petch, 1924; Brues, 1928; Lindner, 1928; Brantjes, 1980; Costa, Hime, 1983; Wolda, Sabrosky, 1986; Hall, Brown, 1993). T. Petch (1924) в своей работе сообщил, что цветки некоторых видов Aristolochia (A. bracteata, A. elegans, A. indica) посещает только один вид насекомых; он обнаружил более 128 мух (все принадлежат только одному виду), пойманных в одном цветке A. elegans. Другие виды рода Aristolochia привлекают несколько видов потенциальных опылителей, например, A. leuconeura имеет 13 видов посетителей (Petch, 1924). Посетители цветков A. clematitis представлены, главным образом, представителями сем. Chironomidae, Ceratopogonidae и Bibionidae (Miiller, 1883; Daumann, 1971; Havelka, 1978, 1983). Основными опылителями бразильских видов A. pilosa и A. arcuata являются представители семейств Chloropidae и Milichiidae, a Lauxanidae и Phoridae опыляли A. melastoma (Brantjes, 1980; Wolda, Sabrosky, 1986). В Японии вид Megaselia sakai посещает цветки Л. inflata, а виды Drosophilla spp. отмечены на цветках A. maxima (Sakai, 2002).
Виды рода Aristolochia проявляют специализацию опыления. Пространство между гиностемием и полостью стенки (s) коррелирует с высотой торакса (h) фактического опылителя (мухи). Так, у A. esperanzae пространство s составляет 1.3-6.0 мм, а высота торакса их опылителей h - 1.3-3.2 мм; у A. cymbifera s = 1.6-3.2 мм, h = 1.6-2.6 мм; у A. brasiliensis, s = 1.0-1.3 мм, h = 1.0-1.6 мм. Таким образом, неопыляющие посетители могут различаться среди опылителей, т.е. очень маленькие Phoridae, Cloropidae и Drosophilidae, попадают внутрь и свободно покидают цветки A. esperanzae, A. cymbifera, A. brasiliensis без опыления (Brantjes, 1980).
Цветки представителей сем. Aristolochiaceae часто дихогамные (Жизнь растений, 1980; Нои, 1983). Протогинию у некоторых представителей рода Aristolochia наблюд,уги Е. Варминг (1893), Р. Ветштейн (1912), S. Sakai (2002). В противоположность этому В.М. Johri, S.P. Bhatnagar (1955) сообщают, что цветки A. indica и A. bracteata протоандричные, но при изучении микрогаметогенеза и мегагаметогенеза у A. bracteata, эти авторы выявили одновременное созревание мужского и женского гаметофитов, следовательно, цветки этого вида ни протогиничные, ни протоандричные.
По мнению Т. Petch (1924), у представителей сем. Aristolochiaceae можно ожидать различные степени самонесовместимости или самосовместимости. Как отмечает D. Нои (1983), М. Proctor и P. Yeo обнаружили физиологические адаптации, предотвращающие самооплодотворение у ряда представителей семейства. У некоторых видов рода Aristolochia отмечена автогамия (самоопыление), например, у A. barbata, A. ornithocephala (= A. brasiliensis) (Burck, 1890, 1892), A. ringens (Petch, 1924), A. serpentaria (Pfeifer, 1966). Иногда представители семейства "перестраховываются". Так, по данным K.L. Lu (1982), у Asarum caudatum в природных условиях северной Калифорнии цветки протогиничны и восприимчивы для перекрестного опыления примерно неделю, после этого проходит самоопыление. Из наблюдений автор заключила, что автогамия является преобладающей у этого вида. Подобную ситуацию описал С.А. Backer (1918) и D. Нои (1981) у Арата (= Thottea) tomentosa на о. Ява. Цветки у вида протогиничные, и при раскрытии тычинок возможно самоопыление.
Цитологическое изучение репродуктивных органов
Для цитологического исследования репродуктивных органов фиксировали 25 цветков, собранных с 5 растений A. manshuriensis. Изучение динамики цветения проводили на 150 бутонах 3 растений на территории Ботанического сада-института (БСИ) ДВО РАН и в пригороде Владивостока в условиях частной коллекции в период массового цветения с 15 по 25 мая 2003 и 2004 гг. Определение семенной продуктивности проводили на 1 500 цветках 5 растений, потенциальную семенную продуктивность (ПСП) и фактическую семенную продуктивность (ФСП) подсчитывали на 44 плодах с 5 растений. Опыты по изучению системы опыления проводили на 5 интродуцированных растениях.
Материал для аллозимного анализа был получен в ходе экспедиций, проведенных в 2001-2004 гг. За этот период были обследованы естественные местообитания A. manshuriensis, известные по литературньм данным (Воробьев, 1968; Куренцова, Валова, 1969; Слизик, 1978 а), по гербарным образцам, хранящимся в Дальневосточном региональном гербарии (VLA) при Биолого-почвенном институте ДВО РАН и гербарии Ботанического сада им. Комарова (г. Санкт-Петербург) (LE). Пункты сбора показаны на рчс. 2.1. Описание выборок, количество растений в каждой выборке и годы сбора материала приведено в табл. 2.1.1.
Материалом для изоферментного анализа служили замороженные в жидком азоте листья 215 растений A. manshuriensis. Образцы растений для изоферментного анализа взяты из трех природных популяций, приуроченных к бассейнам рек Нежинка (61 растений), Ананьевка (45 растений) и Малая Борисовка (109 растений) (Надеждинский, Хасанский и Уссурийский районы Приморского края). Внутри популяций кирказон маньчжурский обычно растет в поймах рек, не поднимаясь выше определенной высоты, с неравномерной плотностью, образуя "пятна" плотных монодоминантных групп. Иногда встречаются единичные особи на расстоянии друг от друга 0.5 км и более, особенно это характерно для растений из популяции реки Борисовка и ее притока (Малая Борисовка), где пятнистая структура выражена слабо. Для аллозимного анализа в каждой популяции были собраны образцы листьев случайно выбранных растений из таких монодоминантных групп. Поскольку в литературе описано как семенное размножение в природных популяциях A. manshuriensis (Слизик, 1978 а, б), так и вегетативное (Куренцова, 1968; Куренцова, Валова, 1969), для сбора проб выдерживали расстояние между растениями в группе не менее 15 м, расстояние между группами внутри каждой популяции варьировало от 300 м до 4 км.
Для изучения строения андроцея и гинецея брали цветки на разных стадиях цветения. Для изучения скорости прорастания пыльцевой трубки собирали пестики с нанесенной на рыльце пыльцой. Весь материал фиксировали в FAA (формалин, уксусная кислота и этиловый спирт в пропорции 7 мл: 7 мл: 100 мл), с временным интервалом в 5 мин. Завязи, столбики и пыльники заливали в парафин по общепринятой методике (Паушева, 1970). Срезы толщиной 8-Ю цм делали на санном микротоме. Препараты окрашивали железным гематоксилином и альциановым синим по модифицированной методике Камелиной О.П. с соавторами (1992). Для исследования фертильносте пыльцы использовали ацетокарминовый метод (Паушева, 1970). Препараты исследовали с помощью микроскопа LM 2 при увеличении об. 6.3Х, 16Х, 40Х, 90Х и ок. РК 10х15.5Х.
Для морфологического изучения пыльцы использовали антморфологический метод изучения пыльцы, предложенный С.С. Хохловым (1978) для исследования апомиктичных форм растений. Для этого тонким пинцетом удаляли раскрытые и не раскрытые пыльнике из цветков и помещали их в пробирки с фиксатором Чемберлена (70 % этиловый спирт, 40 % формалин, ледяная уксусная кислота, в соотношении 90:5:5). Далее один или несколько зафиксированных пыльников из смеси Чемберлена помещали на предметное стекло в каплю ацетокармина. Для приготовления красителя 2 г кармина на водяной бане растворяли в смеси 55 мл воды и 45 мл уксусной кислоты; раствор оставляли для насыщения на ночь и в течение следующего дня фильтровали. Под бинокуляром осторожно отделяли пыльцу, удаляя пустые оболочки пыльников. Каплю ацетокармина с пыльцой покрывали покровным стеклом. Затем препарат переносили под микроскоп.
Во избежание субъективных отклонений при подсчете пыльцевых зерен анализируемые поля зрения располагали на препарате по определенной системе, в зависимости от количества пыльцы. Чем меньше пыльцы, тем более редкой сеткой покрывали препараты просчитываемыми полями зрения вплоть до полного подсчета зерен под всей поверхностью покровного стекла; число подсчитанных на препарате зерен пыльцы составляло выборку - 200 штук. Наблюдаемую и подсчитываемую пыльцу разбивали на классы, которые наиболее часто встречались при наблюдении (Хохлов, 1968). Степень дефектности пыльцы выражает долю дефектности пыльцевых зерен в процентах от их общего числа. Степень дефектности пыльцы у вида высчитывали как среднее из степени дефектности пыльцы отдельных экземпляров.
Для установления периода восприимчивости рыльца использовали методику I. Robinsohn (1924). Для этого рыльца на разных стадиях развития и цветения (от стадии І бутона (10 дней со дня появления.из пазухи листа) до их увядания), помещали в 1-2 % раствор КМпСч на 1-2 мин, после этого промывали проточной водой в течение 5-Ю мин и просматривали под бинокуляром. Рыльца, восприимчивые к пыльце (выделяющие секрет), после этой процедуры имели буро-коричневую окраску; соответственно, не восприимчивые рыльца такое окрашивание не проявляют.
Для проведения электронного сканирующего микроскопического исследования поверхности пыльцевого зерна, пыльники и пыльцевые зерна фиксировали в глютаровом альдегиде в течение трех дней, перед проведением исследования отмывали от фиксатора проточной водой. Далее образцы высушивали, монтировали на специальные подложки, напыляли золотом и исследовали под микроскопом JSM 35 (Jeol). Результаты фиксировали на пленку ПО "Свема" 64 ГОСТ 24876-81.
Морфологическое и анатомическое строение репродуктивных органов
Стилодии плодолистиков, глубоко срастаясь боковыми поверхностями друг с другом, образуют 6-гнездную синкарпную завязь. По расположению завязь нижняя, по форме цилиндрическая (рис. 3.2.1 а). При созревании коробочка растрескивается септицидно-сутурально, постепенно выбрасывая семена.
Эпидерма завязи представлена крупными низкопризматическими, плотно прижатыми друг к другу клетками (рис. 3.2.2). С внешней стороны стенка значительно утолщена, что придает ей жесткость. На поверхности эпидермы находятся трихомы двух типов - крупные и мелкие (рис. 3.2.3). Крупные трихомы, выполняющие защитную функцию, - простые неразветвленные, состоящие из 4-5 клеток. Апикальная клетка сильно вытянута, заострена на конце и иногда загнута книзу.
Мелкие трихомы простые неразветвленные, 1-2 клеточные с булавовидным расширением апикальной клетки - это железистые волоски.
В завязи A. manshuriensis обнаружены по три проводящих пучка в дорзальной части каждого плодолистика и небольшие проводящие тяжи в вентральной части на границе срастания плодолистиков (рис. 3.2.3). Дорзальные проводящие пучки различаются по строению и количеству составляющих элементов. Крупные проводящие пучки коллатеральные открытые. На поперечном срезе проводящий пучок составляют 5-7 клеток ксилемы, флоэма представлена многогранными некрупными клетками. Клетки камбия небольшие. Более мелкие проводящие пучки, расположенные с двух сторон от крупного, по строению коллатеральные закрытые, на поперечных срезах представлены 2-3 элементами ксилемы и 5-7 клетками флоэмы. Вентральные пучки небольшие по размеру, по строению коллатеральные закрытые, их составляют 4-5 элементов ксилемы и 6-9 клеток флоэмы.
В завязи хорошо представлена паренхимная ткань (рис. 3.2.2, 3.2.3). Паренхима рыхлая, состоит из разных по размеру клеток. Мелкие клетки лежат в 2-3 плотных слоях под эпидермой и на границе срастания плодолистиков. Основную часть паренхимной ткани составляют очень крупные клетки с мелкими веретеновидно-вытянутыми ядрами. С внутренней стороны паренхиму подстилают низкопризматические клетки эпидермы. Слой субэпидермы не оформлен.
Во внутренней полости, вдоль швов плодолистиков, расположены многочисленные семязачатки. Семязачатки соединяются с тканями завязи в центральной ее части по краям плодолистиков, что позволяет говорить о центрально-угловой плацентации. Подобное расположение семязачатков приводят В.М. Johri и S.P. Bhatnagar (1955) для A. bracteata.
Известно, что при синкарпном типе гинецея семязачатки закладываются с обеих сторон каждого плодолистика, друг против друга (Эсау, 1969). На поперечных срезах завязи A. manshuriensis семязачатки находятся только с одной стороны плодолистика, т.е. противоположный семязачаток отсутствует. При этом наблюдается разнонаправленность их расположения. Возможно, имеет место редукция противолежащего семязачатка в процессе онтогенеза. Для уточнения этого предположения необходимы исследования более ранних стадий формирования завязи.
Семязачатки анатропные, битегмальные, с хорошо развитыми фуникулюсами. К моменту опыления фуникулюс утолщен до 15-20 клеток. Наружный интегумент A. manshuriensis представлен двумя слоями низко-призматческих клеток, более глубокие слои образованы крупными изометрическими клетками. Внутренний интегумент образован тремя слоями призматических клеток (рис. 3.2.4).
В семязачатке хорошо развиты две зоны: в микропилярной зоне дифференцируется париетальная ткань, в халазальнои зоне - массивньш проводящий пучок из удлиненных клеток, достигающий халазы. Семязачаток крассинуцелятного типа. Нуцеллус массивный, его составляют различные по форме клетки. Эпидерма представлена высокопризматическими клетками. Клетки, лежащие глубже нестрогими рядами, крупные изометрические, - это париетальная ткань. В сформированном зародышевом мешке три слегка вытянутые антиподы расположены в халазальнои части, в микропилярной части находятся две небольшие по размеру клетки грушевидной формы - синергиды и крупная яйцеклетка. Зародышевый мешок Polygonum-типа. Полярные ядра располагаются в центре, до оплодотворения не сливаются.
Пыльники A. manshuriensis биспорангиатные (рис. 3.2.1, 3.2.5), расположены по 4 на каждой из трех сторон столбика. Гнезда пыльника снабжены одним проводящим пучком, который отходит перпендикулярно от центрального проводящего пучка плодолистика. Эпидерма пыльника представлена одним рядом крупных высокопризматических клеток. Связник состоит из клеток губчатой паренхимы, которая сливается с многоугольными клетками паренхимы столбика. С внутренней стороны зрелый пыльник выстилают остатки клеток тапетума.
