Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с накоплением больших массивов данных о последовательностях геномных ДНК получение и тестирование не охарактеризованных в биохимическом отношении факторов роста мышц и других белков, лишенных ферментативной активности, может рассматриваться в качестве типовой задачи биотехнологии. В этой связи большую актуальность приобретает систематизация существующих подходов к решению этой задачи в виде универсальной платформы, позволяющей облегчить выбор наиболее быстрого и продуктивного метода получения ранее не исследовавшегося ростового фактора в нативной форме. В свою очередь, расширение спектра доступных для физиологических экспериментов ростовых факторов создает основу для направленного воздействия на рост и развитие мышечной ткани при лечении наследственных и возрастных миодистрофий, в спортивной медицине, при посттравматическом восстановлении и в зоотехнике.
Развитие мышц контролируется как минимум двумя регуляторными системами, которые условно можно назвать миостатин-фоллистатиновая и IGF-соматотропиновая. Ключевыми регуляторными факторами миостатин-фоллистатиновой системы являются миостатин - мощный эндогенный ингибитор роста мышц и его физиологический блокатор фоллистатин. Повышение концентрации миостатина в организме является непосредственной причиной возрастной и наследственных миодистрофий, а генетические дефекты в гене миостатина, напротив, приводят к появлению особей с увеличенной мышечной массой (Lee and McPherron, 2001). Имеющиеся данные свидетельствуют, что снижение уровня миостатина не приводит к нежелательным для здоровья последствиям, поэтому воздействия, направленные на удаление миостатина из организма, могут оказаться перспективными при лечении миодистрофий и в спортивной медицине, а также в зоотехнике. Традиционно для удаления нежелательных факторов из
кровотока используется гемосорбция на иммобилизованных антителах. Однако получение антител против миостатина технически невозможно по причине полной инвариантности миостатина у всех позвоночных. В качестве альтернативы антителам могут быть использованы природные лиганды миостатина - фоллистатин или пропептид миостатина, с которыми он формирует прочные нековалентные комплексы.
Инсулиноподобный фактор роста (IGF) и гормон роста (соматотропин) известны в качестве важнейших позитивных регуляторов мышечных волокон. Недавно в поперечно-полосатых мышцах был обнаружен новый продукт гена IGF, который формируется путем альтернативного сплайсинга. Новая изоформа детектируется только в работающих или поврежденных мышцах, поэтому она получила название механического фактора роста MGF (mechano growth factor). С помощью синтетического MGF и техники ДНК-доставки показана уникальная избирательность действия этого фактора на пролиферацию миобластов - клеток-предшественников мышечной ткани (Yang and Goldspink, 2002). Исследования в данном направлении открывают широкие перспективы медикаментозной стимуляции роста мышц, причем высокая избирательность действия MGF обещает отсутствие нежелательных побочных эффектов. Тем не менее, до настоящего времени исследование физиологической роли и возможностей практического применения MGF ограничено отсутствием рекомбинантных продуцентов этого фактора.
Цель и задачи исследования. Целью работы было создание современной и максимально универсальной схемы получения рекомбинантных факторов роста мышц при помощи экспрессии в Е. coli, оценка нативности пространственной структуры и естественной физиологической активности полученных препаратов.
В число поставленных задач входило-
на примере модельного объекта TNF-a разработать унифицированную схему рекомбинантной продукции и ренатурации белков, не обладающих ферментативной активностью;
разработать дизайн рекомбинантных продуцентов факторов роста мышц - MGF, MSTN, пропептида MSTN, MSTN-связывающего домена FSTN;
разработать системы очистки, ренатурации, оценки функциональной активности полученных рекомбинантных белков in vitro и in vivo,
получить аффинные сорбенты на основе FSTN и пропептида MSTN для удаления избытка миостатина из крови больных миодистрофией, охарактеризовать емкость и специфичность сорбентов.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В результате исследований модельного объекта TNF-a была показана практическая применимость метода сульфонатных производных на этапе солюбилизации тел включения и отработки процедуры ренатурации по сравнению с методом разрыва дисульфидных связей восстановлением. Отработана методика очистки рекомбннантного белка из тел включения при помощи хроматографии в денатурирующих условиях: выявлено преимущество нецеллюлозных матриц (например, ТоуоРеаг]) над целлюлозными (например, Sepharose); показана целесообразность проведения хроматографии при пониженной концентрации мочевины (4 М), связанная с повышением выхода хроматографии и облегчением процедуры ренатурации разбавлением. Функциональный тест на стандартной клеточной линии L929 впервые показал биологическую активность белка TNF-a, лишенного 18-ти а.о. с N-конца, предположительно участвующих в образовании тримерной формы белка.
Путем ренатурации in vitro впервые получен полноразмерный механический фактор роста MGF, ранее изучавшийся только в форме
транскриптов и синтетических фрагментов. Разработана оригинальная методика тестирования выхода ренатурации MGF, основанная на сочетании обращеннофазной ВЭЖХ и функционального теста на клеточных линиях. Впервые количественно измерена цитопролиферативная активность рекомбинантного MGF на линии нормальных (неиммортализованных) миобластов человека.
Использование зеленого флуоресцирующего белка 6-His-GFP (традиционно служащего для маркирования субклеточных структур in vivo) в качестве N-концевого трансляционного тага для экспрессии в Е. coli впервые позволило добиться получения зрелого миостатина человека в форме растворимого продукта. Устойчивость пространственной структуры бифункционального белка б-His-GFP-MSTN и наличие у него характерной для MSTN димерной организации подтверждены фактом сохранения флуоресцентных свойств белка в условиях денатурирующего электрофореза в 12,5% ПААГ.
Впервые предложен способ синтеза MSTN-связывающего домена
фоллистатина в виде слитого белка с б-His-GFP. Показана высокая
эффективность трезилового реагента для получения активированных
сефарозных матриц, пригодных для иммобилизации денатурированных
рекомбинантных белков с последующей ренатурацией in situ. С
использованием рекомбинантного белка 6-His-GFP-FSTN,
иммобилизованного на Sepharose 4В в денатурирующих условиях, впервые получен аффинный сорбент, по специфичности, емкости и гидродинамическим характеристикам пригодный для удаления миостатина в условиях гемосорбции.
Апробация работы. Полученные в ходе выполнения работы препараты факторов роста мышц были использованы в Институте Медико-биологических проблем РАН при выполнении государственных программ МОН РФ «Управление функциональным состоянием человека с целью
повышения работоспособности в экстремальных условиях (в том числе в космическом полете)» и «Медицинские и молекулярно-биологические технологии повышения работоспособности человека в условиях напряженных физических нагрузок». Материалы диссертации были рассмотрены на межлабораторном семинаре ВНК «Биохимия мышц» и лаборатории регуляции биосинтеза белка 11 июня 2008 года.
Структура работы. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 5 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов работы, выводов и списка цитированной литературы (168 источников).
Список сокращений, использованных в автореферате: IGF -
ннсулиноподобный фактор роста; MGF - механический фактор роста; TNF-a - фактор некроза опухолей a; MSTN - миостатин; FSTN - фоллистатин; GFP зеленый флуоресцирующий белок из Aquorea victoria; а.о. -аминокислотный остаток; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ПААГ - полиакриламидный гель, ActD - актиномицин D.
