Введение к работе
1.1 Актуальность проблемы. Для успешного лечения и своевременной профилактики инфекционных заболеваний животных необходим ранний и точный диагноз, что возможно при использовании диагностических тест-систем с высокой специфичностью и чувствительностью. Одной из актуальных задач, стоящих перед биотехнологией РФ, является совершенствование традиционных (РСК, РДП, РНГА, РГА) и разработка новых (ПЦР, ЛЦР, ДНК-гибридизация, ИФА и другие) и диагностических тест-систем (Обухов И.Л., 1998; Самуйленко с соавт., 2003; Цыбанов С.Ж. с соавт., 2007; Мищенко с соавт., 2008; Гулюкин М.И., 2000-2012; Мельник Н.В., 2012).
Достоверность результатов серологической диагностики зависит от эффективности и качества тест-систем, то есть активности и специфичности компонентов реакции - специфических антигена и сыворотки, от параметров и условий проведения анализа, которые определяются экспериментально для каждой пары антиген-антитело. Поэтому необходимо использовать современные методы фракционирования, очистки и концентрирования вирусных и бактериальных антигенов; способы получения высокоактивных специфических сывороток.
Методы ИФА применяют для диагностики, мониторинга заболевания, своевременного и обоснованного прогнозирования возникновения эпизоотии среди животных. Решением МЭБ иммуноферментный анализ признан референс-тестом, результаты которого определяются в основном природой и свойствами применяемой пары антиген-антитело. Поэтому при работе с каждым новым объектом возникает необходимость изучения параметров проведения иммуноферментного анализа, оптимальных для данного микроорганизма (антигена). Высокая разрешающая способность методов ИФА обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих результаты анализа.
В связи с вступлением России в ВТО перед производителями иммунобиологических препаратов стоит задача повышения их эффективности и качества. Одним из решений этой проблемы является внедрение элементов менеджмента качества (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и Правил GMР (ГОСТ Р 52249-2009) в технологию производства, а именно: гармонизация технологического процесса производства и контроля с международными требованиями; обеспечение стабильности имунобиологических препаратов и технологического процесса их изготовления; проектный подход в обеспечении качества и безопасности иммунобиологических препаратов.
Все изложенное выше явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.
1.2 Обоснование выбора объектов исследования.
По данным ИАЦ Управления Ветнадзора (ФГУ ВНИИЗЖ) хламидиоз сельскохозяйственных животных и ИНАН лошадей входят в перечень 20 нозологических единиц, вносящих основной вклад (80% и более) в заболеваемость разных видов животных.
1.2.1 Хламидиозы сельскохозяйственных животных, методы диагностики.
Значительный вклад в изучение хламидиозов внесли отечественные ученые: Х.З. Гаффаров, В.Н. Сюрин, И.И. Терских, Ю.Д. Караваев, Н.И. Налетов, Р.Х. Хамадеев, А.З. Равилов, И.Л. Обухов и другие.
Хламидиозы - инфекционные заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными микроорганизмами семейства Chlamydiaceae (Everett K.D.E., 1999; Эйдельштейн И.А., 1999; Ямникова С.С. с соавт., 2000; Самуйленко А.Я. с соавт., 2003). Хламидиозы относятся к зооантропонозам, проявляют природную очаговость, характеризуются широким повсеместным распространением в животном мире, тяжестью патологии у людей, высокой стоимостью затрат на проведение противоэпидемических мероприятий (Токаревич К.Н., 1979; Черкасский Б.Л. и др., 1988; Обухов И.Л., 1997; Нехороших З.Н. и др., 2005; Storz J., 1971; Acha et al, 1991; Petersen E.E., 1994; WHO, 1999; Storz J., В.И., 2001). Экономический ущерб в животноводстве от хламидиоза складывается от снижения продуктивности животных, недополучения приплода, падежа и вынужденного убоя молодняка, массовых или спорадических абортов у коров, овец и свиней (Щербань Г.П., 1978; 1984; Бортничук В.А., 1979, 1991; Хамадеев Р.Х., 1987, 1991). В связи с этим в настоящее время всестороннее изучение хламидиозов признано ВОЗ одним из главных направлений.
В системе мер борьбы с хламидиозом наиболее актуальной признана ранняя и точная диагностика, с учетом результатов которой возможна организация ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и искоренению хламидийной инфекции. Наличие общего для всех штаммов хламидий группоспецифического антигена делает возможным использовать для диагностики заболевания серологические методы (Ильинский Ю.А.,1974; Гусев Б.Н., 1991; Маликова М.В., 1995; Обухов И.Л., 1998; Белоусов В.И., 1999; Anderson I.E., 1986; Delong W.J., 1986; Acha P., 1991; Fukushi H., 1995; Martin P.K., 1995).
Стандартным серологическим тестом для диагностики хламидиоза, рекомендуемым МЭБ, является реакция связывания комплемента (РСК). Обнаружение комплементсвязывающих антител у большинства индивидуумов в группе с клиническими признаками является предварительным доказательством наличия активной инфекции, а выявление четырехкратного увеличения титра через 14 дней – диагностическим признаком текущей инфекции.
Иммуноферментный анализ применяется параллельно с РСК для диагностики хламидиоза и прогнозирования возникновения эпизоотии среди животных.
Несмотря на успехи в изучении хламидиозов, качество ретроспективной диагностики и прогнозирование эпизоотий не всегда удовлетворяют требованиям ветеринарной медицины. Поэтому разработка и совершенствование промышленных технологий производства наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных являются своевременными и актуальными.
1.2.2 Инфекционная анемия (ИНАН) лошадей. Согласно принятой классификации возбудителем заболевания является вирус подсемейства Lentivirus семейства Retroviridae (Nakajima H., 1994).
Большой вклад в изучение ИНАН лошадей внесли отечественные ученые: К.П. Юров (1972 - 2013), Ю.Д. Караваев (1987), Б.И. Токарик (1976 - 1989), Л.И. Пронина (1981; 1984), В.К Сологуб. (1975), В.Н. Сюрин (1991).
РДП – «золотой» стандарт - является наиболее точным и надежным методом специфической диагностики ИНАН, так как позволяет обнаруживать специфические антитела в крови лошадей, инфицированных вирусом различающихся штаммов, клонов и изолятов в начале и на протяжении всей болезни (Clabough D.L., 1990).
В России РДП официально принята для диагностики ИНАН и выпускается по технологии, разработанной во ВНИТИБП, тест-система РДП, в состав которой входит специфический преципитирующий антиген из ткани селезенки лошади, экспериментально инфицированной вирусом.
Препарат антигена из ткани селезенки лошади – высокоспецифичен, однако для его производства требуется большое количество лошадей, что приводит к значительным материальным затратам, к снижению стандартности препарата из-за большого разнообразия разнообразия сырья и не исключает вероятности заболевания людей, контактирующих с инфицированными животными (Henson J.B., 1971; Сюрин В.Н., 1998).
Иммуноферментный анализ применяется параллельно с РДП для диагностики инфекционной анемии, а также для массового скрининга лошадей, находящихся в карантине (Proc. Am. Meet. United States Anim. Health Assn, 1991; Kenna J.G., 1985; Patricon M.C., 1981; Archambault D., 1989; Sobiech E., 1991; Sugiura T., 1995).
Таким образом, разработка на основе антигена культурального вируса диагностических тест-систем РДП и ИФА для определения антител с целью диагностики ИНАН и индикации антигена в процессе культивирования представляется своевременной и обоснованной.
1.3 Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований – разработка и совершенствование промышленной технологии изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных (РСК, ИФА) и для диагностики ИНАН лошадей (РДП, ИФА).
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Научно обосновать выбор и способ культивирования производственных штаммов микроорганизмов для изготовления компонентов наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных (РСК, ИФА) и ИНАН лошадей (РДП, ИФА).
2. Разработать промышленную технологию изготовления наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных:
- разработать технологические процессы получения и контроля посевных материалов хламидий штамма «Улетово–96-ВНИиТИБП», получения, очистки и концентрирования антигена, получения специфичных гипериммунных сывороток, стабилизации свойств компонентов набора методом сублимационного высушивания;
- сконструировать набор (тест-систему) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных;
- изготовить опытные образцы наборов (тест-систем) и провести их исследования на соответствие показателям качества (специфичность, чувствительность, воспроизводимость и др.);
- разработать нормативную документацию на наборы (тест-системы) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных и освоить их промышленный выпуск;
- оценить качество наборов и эффективность их применения.
3. Усовершенствовать и разработать на основе антигена культурального вируса ИНАН технологию производства тест-системы РДП для диагностики инфекционной анемии и тест-систем ИФА для определения специфических антител и индикации вирусного антигена:
- разработать технологический процесс получения и контроля посевных материалов культурального вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ»; совершенствовать тест-систему РДП;
- разработать комплексную тест-систему ИФА для диагностики ИНАН лошадей и индикации антигена вируса ИНАН;
- изготовить опытные образцы тест-систем и провести их исследования на соответствие показателям качества (специфичность, чувствительность, воспроизводимость и др.);
- разработать НД на тест-системы РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.
1.4 Научная новизна результатов исследования.
Научно обоснован выбор и способ культивирования производственного штамма хламидий для изготовления наборов (тест-систем) РСК, ИФА для диагностики хламидиоза животных:
- методом ПЦР проведена молекулярно-генетическая идентификация штамма хламидий с использованием специфичных к Chlamydia psittaci олигонуклеотидных праймеров;
- определена нуклеотидная последовательность амплифицируемых фрагментов ompl- и отр2-генов у хламидий исследуемого штамма;
- показана возможность дифференциации хламидий внутри вида путем электрофоретического разделения продуктов рестрикции амплификатов в агарозном геле;
-исследован морфогенез в желточных мешках КЭ, первично трипсинизированной КК ФЭК и КК МсСоу;
- исследована антигенная активность штамма хламидий;
Штамм хламидий по своим иммунобиологическим свойствам идентифицирован как представитель рода Chlamydophila. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как производственный «Улетово-96-ВНИиТИБП» Сh. рsittaci.
Научно обоснована и разработана технологии промышленного производства наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных и тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.
Разработан способ получения гипериммунной хламидийной сыворотки с использованием иммуностимулятора «Иммунофан».
Разработана тест-система ИФА для индикации хламидийного антигена.
Научно обоснован выбор и способ культивирования производственного штамма культурального вируса ИНАН для изготовления компонентов тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как Lentivirus семейства Retroviridae «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».
Впервые разработана технология изготовления тест-систем для определения антител к вирусу ИНАН в сыворотке крови лошадей и индикации антигена вируса ИНАН методами иммуноферментного анализа (Патент РФ №21461150, приоритет от 10.03.00 г. с соавтор.).
Разработана комплексная тест-система ИФА для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей.
Усовершенствованы и разработаны:
- технологические схемы получения и контроля посевных материалов хламидий щтамма «Улетово–96-ВНИиТИБП» и культурального вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ»;
- технологический процесс изготовления препарата хламидийного антигена из желточных мешков КЭ;
- тест-системы ИФА для диагностики хламидиоза овец и КРС;
- «малодозная» тест-система РДП для диагностики ИНАН лошадей.
1.5 Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость проведенных исследований заключается в определении методологии разработки промышленной технологии изготовления наборов (тест-систем) РСК, РДП и ИФА; изготовлении и испытании опытных серий наборов (тест-систем); внедрении в производство наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза, РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.
С учетом требований Правил GMP (ГОСТ Р 52249-2009) разработана и утверждена в установленном порядке Нормативная документация: технологические регламенты, стандарты организации, ТУ и инструкции по применению. Результаты исследований включены в методические положения
и методические рекомендации.
Разработаны технологии производства наборов (тест-систем) для диагностики: хламидиоза животных в РСК и РДСК; хламидиоза овец и КРС и индикации хламидийного антигена методом ИФА; ИНАН лошадей в РДП; комплексной тест-системы ИФА для индикации антител и антигена вируса ИНАН.
По результатам исследований разработаны паспорта производственных штаммов хламидий «Улетово-96-ВНИиТИБП» и культурального вируса ИНАН «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ». Штаммы депонированы в коллекции ВГНКИ.
При непосредственном участии автора внедрены: на базе Опытного производства ГНУ ВНИТИБП промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных в РСК, РДСК и ИФА; на базе ФГУ «ЩБК» - технология изготовления на основе антигена культурального вируса тест-системы «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии (ИНАН) лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле». Промышленное производство осуществляется в соответствии с нормативной документацией, утвержденной в надлежащем порядке (Технологический регламент, Технические условия, Инструкция по применению, Стандарт организации).
За период 2001-2013 г.г., для практического применения в соответствии с Государственными заказами МСХ РФ и прямыми договорами на Опытном производстве ГНУ ВНИТИБП изготовлено 27584 наборов для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК. Рекламаций на качество наборов не поступало.
Разработки по материалам диссертационной работы награждены: 2 золотыми медалями ВВЦ (свидет. №77 от 18.02.09 г.; свидет. №681 от 12.10.09 г.) и Дипломами I степени (Российская агропромышленная выставка «Золотая осень», 2012 г., золотой медалью конкурса в рамках выставки-конференции «Биоиндустрия 2011» (17 –19 мая 2011 года), г. Санкт – Петербург. Автор работы удостоен общественной медали «За развитие биологической науки и промышленности», 2009 г.
1.6 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1. Обоснование выбора и способа культивирования производственных штаммов хламидий для изготовления наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных и культурального вируса ИНАН для изготовления тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.
2. Промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных.
3.Промышленная технология изготовления тест-систем для диагностики ИНАН лошадей.
1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В работе приведены результаты исследований по специальности 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнология). Результаты научных исследований соответствуют пунктам 1, 3, 8, 11 паспорта специальности.
1.8 Апробация результатов исследования. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам заданий НИР на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ГНУ ВНИТИБП (1980 – 2012 г.г.); на 18 Всероссийских научно-практических конференциях (Щелково 1995-2013 г.г.); на заседаниях секции «Ветеринарная биотехнология» отделения
«Ветеринарная медицина» РАСХН (2011-2013 г.г.); 10 Международных научно-практических конференциях, проводившихся в Щелково, Москве, Курске, Троицке, Покрове, Тарту, Алуште, Петербурге, Владимире, Харькове (1991 – 2013 г.г.).
1.9 Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 56 печатных работах, в том числе 12 статей в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикаций материалов докторских диссертаций; 3 патента РФ.
1.10 Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на…. страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего …. источника, в том числе …. иностранных и ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована… таблицами и …рисунками.
1.11 Место выполнения работы. Работа выполнена в 1986-2013 г.г. в лаборатории разработки промышленной технологии изготовления диагностических препаратов (зав. лаб., к.б.н. Токарик Б.И), отделе обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии (зав. отд., д.б.н. Еремец В.И.) и на Опытном производстве ГНУ ВНИТИБП РАСХН. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с сотрудниками Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (зав. лаб., д.б.н. Ямникова С.С.), ВИЭВ (д.в.н. К.П. Юров), ФГУ «ЩБК» (д.б.н. Скичко Н.Д., Павленко В.С., д.в.н. Зенов Н.И.), д.б.н. В.И.Еремец – организация опытного производства.
1.12 Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, теоретическом и методологическом обосновании поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимала личное участие в апробации, внедрении разработанных технологий и промышленном производстве диагностических наборов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.
1.13 Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН, академику НААН Украины А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали консультативную и практическую помощь сотрудники института к.б.н Б.И. Токарик, д.б.н. В.И. Белоусов, д.б.н. Э.Ф. Токарик, д.б.н. В.И. Еремец, д.б.н. А.А. Нежута, к.б.н. Т.А. Авдеева, к.б.н. Б.Е. Блехерман, к.в.н. Е.Э. Школьников, к.б.н. Н.И. Емельянов, к.б.н. Г.Ф. Виногорова, И.П. Фисенко, Г.В. Пестова, Н.Г. Лысенко, Т.Г. Татарская, к.б.н. Н.К. Еремец, д.б.н. Л.А. Неминущая, д.б.н. Т.А. Скотникова, М.А. Малышева, а также сотрудники Института вирусологии им. Д. И. Ивановского д.б.н. С.С. Ямникова, к.б.н. И.Т. Федякина, ВИЭВ – д.в.н. К.П. Юров, ФГУ «ЩБК» - д.б.н. Н.Д. Скичко, д.в.н. Н.И. Зенов, В.С., В.С. Павленко, за что приносим им сердечную благодарность.
