Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Бешенство животных 17
1.1.1. Сравнительная оценка методов диагностики бешенства животных 17
1.1.2. Методы прямого обнаружения антигена вируса бешенства 18
1.1.3. Методы выделения вируса бешенства 23
1.1.4. Сравнительная оценка диагностической пригодности тестов 25
1.2. Лабораторная диагностика лептоспироза.. 27
1.2.1. Краткая характеристика основных методов диагностики 27
1.2.2. Рестрикционный анализ как таксономический метод 31
1.2.3. ДНК-ДНК гибридизация в диагностике лептоспироза 33
1.3. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота 34
1. 3.1. Введение 34
1.3.2. Диагностика инфекционного ринотрахеита КРС 36
1.3.2.1. Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита 36
1.3.2.2. Иммуноферментный метод для диагностики инфекционного ринотрахеита 39
1.3.2.3. Диагностика ИРТ с помощью гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции 40
1.3.3. Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых 42
1.3.3.1. Общие положения в диагностике инфекции 42
1.3.3.2. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) 48
1.3.4. Лабораторная диагностика PC инфекции 52
1.3.5. Лабораторная диагностика парагриппа-3 56
1.3.5.1. Серодиагностика и ретроспективная диагностика 56
1.3.5.2. Сравнение методов серодиагностики парагриппа-3 59
1.3.6. Диагностика аденовирусной инфекции 60
1.3.6.1. Серологическая идентификация 62
1.3.6.2. Серодиагностика PI ретроспективная диагностика 65
2. Собственные исследования 66
2.1. Материалы и методы 66
2.1.1 .Штаммы 67
2.1.2.Инфекционность вируса 68
2.1.3 .Культуры клеток и среды 68
2.1 ААнтитела и антигены .* 69
2.1.5 .Сыворотки 70
2.1.6.Выделение и очистка Ig G 71
2.1.7.Непрямой иммуноферментный анализ 71
2.1.8.Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы ИФА л... 72 -
2.1.9.Молекулярное клонирование ДНК L. pomona 72
2.1.10.Статистическая обработка результатов 73
3. Результаты собственных исследований 74
3.1.Усовершенствование технологии получения антирабической сыворотки для промышленного производства диагностических ФИТЦ-коньюгатов 74
3.2. Молекулярное клонирование ДНК L.interrogans серовара pomona для идентификации и дифференциации лептоспир 76
3.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир 76
3.2.2. Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара pomona 77
3.2.3. Получение фрагментов ДНК L. interrogans серовара pomona 78
3.2.4. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид 81
3.2.5. Анализ рекомбинантных плазмид в реакции ДНК-ДЬЖ гибридизации 81
3.2.6. Применение рекомбинантных плазмид для идентификации и дифференциации лептоспир 88
3.2.6.1. Применение плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 для идентификации референтных штаммов лептоспир 88
3.2.6.2. Получение ДНК-зондов для идентификации полевых изолятови производственных штаммов лептоспир 93
3.2.6.3. Определение специфичности ДЬЖ L.pomona на коллекции штаммов различных видов микроорганизмов 94
3.2.6.4. Дифференциация производственных штаммов лептоспир 96
3.3. Разработка технологии получения компонентов комплексной тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антител-к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ЬЗД-БС, PC и АВ 102
3..3.1. Промышленное культивирование клеток ПТ-80 103
3.3.2. Очистка и концентрирование вирусов и получение антигенов для ИФА 104
3.3.2.1. Вирус парагриппа-3 . 104
3.3.2.1.1. Репродукция вируса парагриппа-3, штамм «ЗКСМ» 104
3.3.2.1.2. Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 106
3.3.2.1.3. Получение антигена для иммуноферментного анализа ПГ-ЗЬСРС 117
3.3.2.1.4. Изучение белков вируса ПГ-3 из вируссодержащих суспензий 117
3.3.2.2. Получение аденовирусных антигенов для ИФА 119
3.3.2.3. PC-вирус 120
3.3.2.3.1. Репродукция PC-вируса, штамм «Randall» 120
3.3.2.3.2. Очистка и концентрирование PC-вируса 123
3.3.2.4.ВирусИРТ 129
3.3.2.4.1. Репродукция вирусаИРТКРС 129
3.3.2.4.2. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС 130
3.3.2.5. Вирусная диарея-болезнь слизистых 140
3.3.2.5.1 .Очистка и концентрирование ВД-БС 140
3.3.3. Культивирование St. aureus и очистка протеина А 141
3.3.4. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови КРС 143
3.3.5. Получение анти-IgG КРС гипериммунной сыворотки 146
3.3.6. Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) 147
3.3.7. Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена 150
3.3.8. Получение специфических к вирусам ИРТ, ПГ-3,ВД-БС, PC, АВ и отрицательной референс сывороток КРС 153
3.3.8.1. Получение специфических к вирусам сывороток крови 153
3.3.8.2. Получение отрицательной референс-сыворотки крови 155
3.3.9. Постановка, учет и критерий оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к ., антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ 157
3.3.9.1. Оптимизация условий постановки комплексной иммуноферментной тест-систем 157
3.3.9.2. Определение рабочего разведения сывороток 159
3.3.9.3. Определение оптической плотности (ОП450) контрольных сывороток 161
3.3.9.4. Определение критериев оценки результатов ИФА 162
3.3.10. Контроль воспроизводимости результатов определения антител комплексной тест-системой ИФА 165
3.3.11. Оценка эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ в сравнении с методами аналогичной направленности 165
3.3.12. Исследование молозива коров на наличие антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ в комплексной тест-системе ИФА 171
3.3.13. Применение комплексной иммуноферментной тест-системы для серологического мониторинга респираторных болезней КРС... 172
4. Обсуждение результатов исследований 174
5. Выводы 210
6. Практические предложения 213
7. Список литературы 216
Приложение 256
- Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита
- Применение плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 для идентификации референтных штаммов лептоспир
- Дифференциация производственных штаммов лептоспир
- Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Одним из основных направлений биотехнологического производства является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами.
Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества, стандартизация диагностикумов для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей.
Реализация идеи создания диагностических наборов требует решения сложных и разнообразных задач. Это, прежде всего, выделение и изучение структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств антигенных фракций вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определение их роли в иммунитете. Приготовление высокоактивных специфических сывороток требует наличие максимально очищенных антигенов, хорошо воспроизводимых схем иммунизации, оптимального донора, а также изучение возможности применения современных эффективных иммуностимуляторов.
Каждый диагностический набор содержит строго индивидуальный состав специфических и химических компонентов, применение которых по отработанной для данной инфекции методике, позволяет достигать желаемой цели исследования.
Многообразие симптомов проявления вирусных и бактериальных болезней, а часто их ассоциация, затрудняет постановку диагноза, поэтому этиологический диагноз должен основываться на результатах лабораторных исследований, включая серологический анализ.
В этой связи актуальным является совершенствование методов диагностики вирусных и бактериальных инфекций и разработка технологии изготовления моно- и комплексных диагностикумов.
Оперативный анализ структуры заболеваний, определение этиологической роли каждого возбудителя в условиях ассоциативных форм инфекций предполагает использование ИФА как метода комплексной дифференциальной диагностики в составе поликомпонентных диагностических тест-систем.
1.2. Обоснование выбора объектов исследования. К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. В настоящее время в Российской Федерации сложилась напряженная эпизоотическая ситуация с бешенством животных, имеющим большое социально-экономическое значение. Активные природные очаги бешенства зарегистрированы в различных регионах страны. Эпизоотии бешенства поддерживаются в основном за счет диких животных, однако в процесс активно вовлекаются бродячие собаки и кошки. (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001)
Основным средством борьбы с бешенством является эффективная специфическая иммунопрофилактика и своевременная диагностика.
Достоверность диагностики находится в зависимости от качества используемых реагентов: активности и специфичности антирабических иммуноглобулинов. Поэтому очень важно своевременно совершенствовать и проводить промышленный выпуск эффективных компонентов диагностикумов бешенства животных.
Лептоспироз относится к числу распространенных природноочаговых, зооантропонозных, опасных в социальном и экономическом отношениях болезней.
Молекулярно-биологичсекие методы играют важную роль при изучении систематики патогенных лептоспир, поиска возможностей их дифференциации и идентификации на основании сравнения генотипов. Наличие фундаментальных исследований нуклеиновых кислот лептоспир, а также работ по геносистематике этих организмов позволяет сделать вывод о возможности применения методов биотехнологии для решения проблем, связанных с лептоспирозом. Так, используя метод ДНК-ДНК гибридизации, возможно выявление специфических фрагментов генома возбудителя лептоспироза, на основании которых делается заключение о наличии или отсутствии лептоспир в инфекционном материале. Интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир позволяют проводить анализ возможностей практического применения рестриктазного анализа и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации. В связи с этим были предложены или разрабатываются методы, позволяющие выявлять индивидуальные особенности сероваров на уровне хромосомной ДНК лептоспир (Le Febure R.B.,1987; Van Eys G., 1989; Pacciarini M.L.,1992, Merien F. et al.1992).
Неоценимый вклад в изучение лептоспироза внесли отечественные ученые Токаревич К.Н. (1947г.), Ананьин В.В. (1949,1951 г.), Киктенко В.С.(1938,1970-1983гг.), Любашенко С.Я.(1945г.), Малахов Ю.А. (1971,1979,1992), Ежов Г.И. (1979,1983,1985гг.) и другие. До настоящего времени общепринятым методом диагностики лептоспироза остается реакция микроагглютинаци (РМА).
Массовые заболевания телят с симптомами поражения дыхательных путей представляют наиболее сложную серьезную проблему для животноводческих хозяйств во многих регионах России.
В связи с этим остаётся актуальной проблема серологического мониторинга и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации животных на ограниченных площадях, при постоянном перемещении из одной технологической группы в другую, формировании новых групп не всегда однородных по возрасту и иммунному статусу, часто проявляются у молодняка.
Так как в инфекционном процессе могут участвовать большое число микроорганизмов различной природы, как правило, значительная роль принадлежит нескольким возбудителям - инфекционному ринотрахеиту (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), парагриппу-3, респираторно-синцитиальной (РС) и аденовирусной (АВ) инфекциям. Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии ещё и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики указанных выше вирусных болезней крупного рогатого скота.
Значительный вклад в изучение вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота внесли Бучнев К.Н. (1965), Назаров В.П. (1967), Макаревич В.Г. (1967), Куличкин В. (1951), Сюрин В.Н. (1978), Халенев Г.А. (1975), Гуненков В.В (1975), Мищенко В.А. (2001), Красочко П.А. (1997), Глотов Г.П.(1998), Кузнецова С.В. (1991), Жидков С.А. (1994), Юров К.П. (2003) и другие ученые.
Респираторные болезни являются основной причиной вынужденного убоя и гибели телят в послеотъемный период. По широте распространения, смерти, вынужденному убою, недополучению привесов они превалируют над всеми другими патологиями.
Популярность ИФА для изучения бактериальных и вирусных инфекций широка. ИФА пришел на смену трудоёмким, малопроизводительным и часто недостаточно чувствительным методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации, связывания комплемента.
Важным этапом контроля и искоренения заболеваний является лабораторная диагностика инфекций, которая в большинстве случаев основывается на выявлении специфических антител в сыворотках крови инфицированных и переболевших животных. В настоящее время разработаны средства и методы диагностики, позволяющие в короткие сроки выявлять большинство инфекционных заболеваний. Однако диагностика при смешанных инфекциях представляет сложную, но актуальную проблему и требует разработки и внедрения в ветеринарную практику современных диагностических наборов на основе высоко чувствительных множественно -антигенных тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА).
Несмотря на то, что диагностика многих моно - инфекций решена на уровне практического применения наборов ИФА, ветеринарная практика России не располагает диагностическими наборами для проведения комплексного дифференциального серологического мониторинга респираторных инфекций крупного рогатого скота. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы может служить создание тест-систем ИФА, в которых число антигенов и их природа зависит от цели исследования.
Перечисленные выше нерешенные вопросы, указывают на актуальность намеченных исследований.
1.3. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является совершенствование и разработка современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1. Усовершенствовать получение антирабических гипериммунных, а также противовирусных, специфических анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД- БС, анти-РС, анти-АВ и отрицательных-референс сывороток крови животных.
2. Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и аденовирусной инфекций в биологических жидкостях организма животных.
3. Оптимизировать условия проведения комплексной тест-системы ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, взятых в одном разведении.
4. Определить диагностическую ценность разработанной комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и аденовирусной инфекций в сравнении с методами аналогичной направленности.
5. Разработать технологию производства и применения комплексного ИФА-набора с определением стабильности его компонентов при хранении.
6. Провести испытание комплексной тест-системы ИФА по выявлению специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС, АВ в практических условиях с использованием сывороток крови крупного рогатого скота, полученных от иммунных и неиммунных животных различных половозрастных групп.
7. Клонировать ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе, создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих случайные фрагменты генома L. pomona. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.
8. Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona, пригодный для использования в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда. Исследовать возможность применения клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.
1.3. Научная новизна.
Усовершенствована схема получения гипериммунной антирабической сыворотки.
На основе иммунохимически охарактеризованных специфических реагентов разработан метод комплексного непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекций в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и оптимизированы условия его проведения при исследовании сывороток крови животных, взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью разноплановых методов оценки специфического гуморального иммунного ответа (положительные решения на изобретение № 2008126759 и №2008126758).
В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения высокоактивных специфических положительных и отрицательных референс-сывороток.
Разработана технология изготовления иммунореагентов комплексной иммуноферментной тест-системы для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БC, РС и АВ инфекций крупного рогатого скота.
Проведено молекулярное клонирование фрагментов ДНК L. interrogans серовара pomona и на основе этого создан банк нуклеотидных последовательностей генома лептоспир. Получен ДНК-зонд, позволяющий дифференцировать производственные штаммы лептоспир.
Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением: по заявкам на изобретение № 2008126759 и №2008126758.
1.4. Практическая значимость работы. Результаты НИР внедрены в ветеринарную практику.
Схема получения антирабической сыворотки иммунизацией баранов фиксированным вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", выпускаемых ВНИТИБП по Госконтракту с Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Получение антирабической сыворотки собаки фиксированным вирусом бешенства штамм "CVS" с полиэлектролитами включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".
Материалы диссертационной работы использованы при составлении "Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", которые утверждены научно-методической комиссией ВНИТИБП 17 сентября 1993 года и используются во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственных и диких животных.
Хроматографически очищенный белок А золотистого стафилококка, конъюгированный с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами использовали в "Инструкции по изготовлению и контролю глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных", утвержденной 22.01.2006 г. директором ВНИТИБП и в "Инструкции по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".
Результаты проведенных исследований позволили разработать "Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на методической комиссии ВНИТИБП и на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1; Временную инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к антигенам вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе и проект нормативной документации. Тест-система ИФА предназначается для индикации и количественного определения антивирусных антител в сыворотках крови, молоке и молозиве крупного рогатого скота.
Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистой, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций позволит решить проблему массового серологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данных заболеваний.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП, в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях:
-на 7 европейской и 9 всесоюзной конференции по лептоспирозу в Москве, 1991 г.;
- на научно-практической конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", 1993 г.;
- на международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов", Щелково,1991 г., 2002 г., 2005 г.;
- на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г., "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных", г. Москва, 2006 г.;
- на международной научно-производственной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных", посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., г. Воронеж, 2006 г.;
- на научно-практической конференции "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" Феодосия, Крым, 2007 г.;
- на Всероссийской научной конференции, "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология", Киров, 2008 г.;
- на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" РАСХН, Щелково-2007 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано - 46 печатных работ, получены положительные решения по заявкам на изобретение 2008126758 и 2008126759.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 46 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 604 наименования, из которых 282 отечественных и 322 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита
Инфекционный ринотрахеит - одна из наиболее опасных респираторных инфекций крупного рогатого скота. Лабораторная диагностика заболевания основана на выделении и идентификации возбудителя в культуре клеток почек, легких и семенников крупного рогатого скота и обнаружения прироста специфических антител в сыворотке крови переболевших животных.
При естественном и экспериментальном заражении вирус индуцирует образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител, которые обнаруживаются в реакции вируснейтрализации (РН), в различных ее модификациях (296, 342), связывания комплемента (РСК) (63, 273) и диффузионной преципитации в геле (РДП) (5, 39). В сыворотке крови переболевших или иммунных животных присутствуют и агглютинирующие антитела, которые выявляются реакцией непрямой (РНГА) или торможения (РТГА) гемагглютинации (36, 43, 114, 148, 532). Присутствие вируса ИРТ в зараженных культурах клеток выявляют по ЦПД и идентифицируют с помощью реакции нейтрализации с заведомо положительной сывороткой. Для постановки РН необходимы чувствительные культуры клеток, заведомо известный контрольный вирус и специфическая сыворотка. Признавая высокую специфичность РН и достоверность ее показаний, нельзя не отметить ее трудоемкость и длительность. Bittsch В. (177) предложил инкубировать смесь вируса с сыворотками в течение 24 часа при 37С. Чувствительность реакции повышается в 16 раз.
В настоящее время широко применяется микрометод постановки РН [255, 271]. Несмотря на трудоемкость и длительность времени для получения результатов, РН до сих пор остается надежным методом идентификации выделяемого вируса и обнаружения антител [246]. Вируснейтрализующие антитела могут быть комплемент-зависимые и комплемент-независимые. В ответ на первичную естественную инфекцию происходит накопление комплемент-зависимых антител, титр их быстро снижается и через 6 месяцев приближается к титру комплемент-независимых антител. Эти различия можно использовать в ретроспективной диагностике для суждения о давности заболевания животного [277].
Специфический антиген удается обнаружить в клетках слизистой оболочки респираторного тракта и гениталий животных с помощью реакции иммунофлуоресценции [44, 46]. Большинство исследователей использовали для обнаружения вируса ИРТ прямой вариант метода иммунофлуоресценции. Непрямой метод имеет ограниченное применение [44, 147].
Одним из методов лабораторной диагностики ИРТ служит реакция диффузионной преципитации в агаровом геле. В качестве антигена применяют нативный материал и культуральную вируссодержащую жидкость. Практикуется микрометод этой реакции (92), в котором с помощью РДП выявляется вирусный антиген в крови, моче, секретах больных животных.
РДП использовалась также для выявления антител к вирусу ИРТ [574]. Ретроспективную диагностику проводят с помощью реакции нейтрализации и непрямой гемагглютинации (РНГА). Применяя реакцию непрямой гемагглютинации, можно обнаружить антитела в более ранний период инфекции, чем с помощью реакции нейтрализации [6, 232, 23]. Спектр эритроцитов, агглютинируемых данным вирусом, определяется экспериментально. Установлено, что вирус ИРТ агглютинирует эритроциты мыши, хомяка, морской свинки, крысы и человека. Эритроциты мыши наиболее эффективны для обнаружения гемагглютинина вируса ИРТ [59]. Крюков Н.Н. с соавторами [60] считают, что для выявления гемагглютинина (ГА) вирус необходимо сконцентрировать. Для этого можно использовать различные физико-химические методы, в частности, ультрацентрифугирование и осаждение ПЭГ. При выявлении вируса, таксономическое положение которого еще не определено, следует учитывать, что агглютинацию эритроцитов мыши вызывают многие вирусы, в частности, парамиксо-, адено-, короно- и ретровирусы крупного рогатого скота. Принадлежность гемагглютинирующего агента (ГА) к вирусу ИРТ определяют при постановке РТГА с известной положительной сывороткой. В результате взаимодействия специфических антител с ГА образуется комплекс, не агглютинирующий эритроциты. Свойство вируса ИРТ вызывать агглютинацию эритроцитов может служить средством быстрой индикации этого возбудителя и количественной оценки его в концентрированных препаратах. Метод диагностики ИРТ в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), легко осуществляемый в любой ветеринарной лаборатории, используется для выявления и количественной оценки специфических антител к вирусу инфекционного ринотрахеита. Титр анти-гемагглютининов коррелирует с титром вируснейтрализующих антител [232, 383]. Серологический метод диагностики ИРТ в РТГА основан на выявлении сероконверсии - прироста антител в сыворотке крови в процессе переболевания инфекционным ринотрахеитом. Он позволяет выявить1 антитела lg М и lgG, в то время, как РН обнаруживает только антитела IgG. РТГА применима не только как диагностический тест, но и для контроля иммунной реакции у вакцинированных животных, при эпизоотологических исследованиях, с целью выяснения ситуации по ИРТ и для подтверждения специфичности гемагглютинации свежих изолятов вируса. Таким образом, быстрый и точный диагноз инфекционного ринотрахеита КРС является решающим условием организации необходимых мер борьбы с ним. Хотя» традиционные методы лабораторной диагностики, принятые ныне, достаточно специфичны и чувствительны, они часто трудоемки И СЛОЖНЫ. С переводом животноводства на промышленную основу, коренным образом изменились принципы и методы лабораторной диагностики вирусных болезней особенно латентных, проявляющих себя, главным образом, на молодняке. Из числа таких методов наиболее перспективен иммуноферментный метод (ИФА) [77, 76, 169, 189]. ИФА - специфичный и универсальный метод, отличающийся.высокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов [104]. В 1980-г. Herring А. и др. [322] сообщили о возможности применения ферментсвязанного иммуносорбентного микрометода для определения антител к вирусу ИРТ. В качестве антигена использовали репродуцированный в культуре клеток вирус вакцинного штамма. Tracherina, очищенный в градиенте плотности хлористого цезия.
Применение плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 для идентификации референтных штаммов лептоспир
В работе использовали комплекс вирусологических, микробиологических, иммунологических, биотехнологических и молекулярно-биологических методов. Вирусологические исследования проводили согласно стандарту МЭБ (QIE Manual, Manual of Standarts// Chapter 2.3.5.,2000; Chapter 2.Ю.6., 2004).
Штаммы. При производстве диагностических препаратов использовали фиксированный вирус бешенства штамм "Овечий" и штамм "CVS" (ВГНКИ, 1997); PC-вирус, штамм "Randall" (ВГНКИ); вирус ИРТ штамм "ТК -А (ВИЭВ) В2"; вирус диареи-болезни слизистых оболочек КРС штамм "Oregon C24V" ( сухая культуральная вакцина против ВД КРС производства Ставропольской биофабрики ТУ-10-19-503-87); вирус парагриппа-3 штамм "ЗКСМ" (ВГНКИ); вакцина инактивированная против аденовирусной инфекции КРС Bovine-10 серотип 1 ТУ 10-09.09-89.
Вакцинные, а также музейные культуры референтных штаммов патогенных лептоспир 23 серогрупп и 3 штаммов двух серогрупп L. biflexa любезно предоставлены кафедрой микробиологии Университета Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы и лабораторией лептоспироза НИИ эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва). Для культивирования St. aureus, использовали полевой изолят золотистого стафилококка, любезно предоставленный сотрудниками бактериологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора (г. Щелково). Штамм А-676 St. aureus получен из НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Чистоту протеина А оценивали в 7% ПААГ на приборе фирмы "Reanal" по методике Davis J.B.(1979).
Инфекционность вируса. Инфекционную активность вирусов определяли путём титрования в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в Ig ТЦД 5о/смз, по общепринятому методу Reed и Mench (1938). Инфекционность PC-вируса определяли на 24-луночных панелях по ТЦД5о/ см3 на культуре клеток ПТ-80 по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу И.П. Ашмарина (1974). Инфекционную активность вируса бешенства определяли согласно «Методам лабораторной диагностики бешенства» и ГОСТ 26075-84. Определение титра инфекционности вируса ИРТ проводили в 96-луночных панелях по ТЦД5о/смз на культуре клеток ПТ-80 согласно «Методам лабораторной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота» (ГОСТ 25755 - 91). Гемагглютинирующий титр вируса ПГ-3 крупного рогатого скота определяли в РТГА с эритроцитами мыши по методике Н.Н. Крюкова и соавт. (1982).
Культуры клеток и среды. Для репродукции и титрования вирусов использовали перевиваемые линии клеток МДВК, ПТ-80, Taurus-1 (Т-1), Тауэр; первично-трипсинизированные культуры клеток почки (ПЭК), лёгкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы. В качестве ростовых и поддерживающих сред применяли среды 199, ГЛАХ, производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва.
Культивирование лептоспир проводили на твин-полисорбат альбуминовой среде согласно методике F. Russel, С. Russel (1986). Антитела и антигены. Исследовали пробы сывороток крови и молозива КРС, поступивших из хозяйств РФ, где наблюдались вспышки респираторных болезней крупного рогатого скота. Специфические антитела к антигенам вирусов ИРТ, PC и ПГ-3 выявляли в реакции нейтрализации (РН) на культурах клеток МДВК и ПТ-80 в 24-луночных планшетах с 100ТЦД5о/смз соответствующего вируса. Антитела к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции определяли в РН на культуре клеток почки эмбриона коровы и в РИГА. Антитела к вирусу ПГ-3 выявляли, используя «Набор диагностикумов ПГ-3 КРС в реакции торможения гемагглютинации» ТУ 46-21-480-78. Антитела к вирусу аденовирусной инфекции определяли, используя «Набор сухих диагностикумов аденовирусной инфекции КРС» ТУ 46-21-939-79. Антитела к ВД-БС КРС определяли с использованием «Набора диагностикумов против ВД КРС» ТУ 46-21-529-79, «Набора для диагностики вирусной диареи-болезни слизистых КРС методом ИФА» ТУ 1007078-92. Перед постановкой РИГА и ИФА испытуемые пробы молозива прогревали в водяной бане при 56С в течение 30 мин разводили ЗФР 1:1 и замораживали при -20С. После оттаивания полученные пробы центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин, отбирали водную фракцию и использовали ее для исследования.
Очистку и концентрирование вирусов ИРТ, ПГ-3, и PC проводили осаждением из вируссодержащих суспензий с использованием ПЭГ различной мол. массой, сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах, ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы.
Антигены вирусов для тест-системы ИФА получали обработкой вирусных препаратов ультразвуком при 22кГц импульсивно в течение 10 секунд на установке УЗДН-2Т или тритоном Х-100 в 1-2% концентрации. Фракционный состав и мол. массу антигенов вирусов для ИФА оценивали методом электрофореза по системе Laemmli U. К. (1970 г.) в блоке SDS-PAGE на оборудовании фирмы "LKB», Швеция. Маркерами мол. массы полипептидов служил набор маркеров фирмы «РЬаптіасіа»,Швеция. Иммуноблотинг проводили переносом белков вирусных препаратов, разделенных в SDS-PAGE, на нитроцеллюлозные мембраны (США,0,54мкм). Антитела из гипериммунных сывороток выделяли методом аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В ("Фармация", Швеция) с иммобилизованными IgG КРС или протеином А в. соответствии с рекомендациями фирмы. Препараты антигенов и антител концентрировали в 10-100 раз методом ультрафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО 2-200 (СКБ АП АН, Ленинград) с мембранами "Владипор" УАМ-150. Сыворотки: В исследованиях применяли экспериментальные (п=450) и коммерческие иммунные сыворотки (п=43) к вирусам ИРТ, ПГ-3, PC, ВД-БС, АВИ, сыворотки КРС боенского происхождения (мясокомбинат им. А.И.Микояна, г.Москва) и из хозяйств РФ, неблагополучных по респираторным заболеваниям. В качестве контрольной положительной сыворотки для ИФА использовали специфические гипериммунные сыворотки, отрицательной -от клинически здоровых КРС, адсорбированных на сорбентах с иммобилизованными антигенами вирусов ИРТ, ПГ-3, PC, ВД-БС, АВИ. В качестве гетерологичных сывороток использовали сальмонеллезные, пастереллезные и хламидийные сыворотки КРС (п=17)« из коммерческих диагностических наборов.
Дифференциация производственных штаммов лептоспир
Нами выполнены эксперименты по гибридизации фрагментов ДНК L. pomona рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37, pLp41 с препаратами ДНК штаммов лептоспир серогруппы Pomona, которые были изолированы от сельскохозяйственных животных и человека на территории России. Одновременно изучали гибридивационную активность клонированных фрагментов по отношению к ДНК производственных штаммов лептоспир. (Таблица 6)
Радиоавтографы ДНК-ДНК гибридизации с молекулярными зондами pLp 37 и pLp41 были почти идентичны друг другу (PHC.14-IV,V,VT). Фрагменты клонированной ДНК, выделенные из рекомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 37, не содержали комплементарных последовательностей в геноме производственного штамма ВГНКИ-4 (серогруппа Tarassovi). Однако плазмида pLp 41 показала положительный сигнал при гибридизации с препаратом ДНК сероварианта tarassovi. Рис.14 (I). ДНК-зонд pLp 23-2 обнаруживал гибридизацию только с образцами ДНК штаммов-изолятов лептоспир, серологически идентифицированных к сероварианту mozdok (РисЛ 4(H)). Фрагменты ДНК рекомбинантной плазмиды pLp 23 в низкой степени гибридизовались с образцами ДНК лептоспир серовариантов monjakov, Pomona и штаммов ВГНКИ-2, ВГНКИ-5 и ВГНКИ-4.
Таким образом, как следует из представленных данных, наименьшая гибридизационная активность с препаратами ДНК, иммобилизованными на фильтре, характерна для ДНК-зондов pLp 23-2 и pLp 23-3. Зато ДНК - зонд, приготовленный из рекомбинантной плазмиды pLp41, показал высокую гибридизационную способность со всеми используемыми в этом эксперименте штаммами лептоспир.
Различные микроорганизмы наряду с лептоспирами могут содержаться в образцах патологического материала, предназначенного для диагностических исследований. На рис. 15 представлены данные эксперимента, который демонстрирует, что нуклеотидные последовательности ДНК L. Pomona рекомбинантных плавмид pLp 23 и pLp 41 не обнаруживали перекрестную гибридизацию с образцами ДНК чужеродных источников.
Препараты ДНК микроорганизмов (Leptospira interrogans, Yersinia pseutuberculosis, Bordetella bronchiseptica, E.coli, Pasteurella multocida, Brucella abortus, Corynebacterium pyogenes, Corynebacteriu rinale, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma luteus) наносили на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали по стандартной методике.
ДНК-ДНК гибридизацию проводили в достаточно мягких температурных условиях (при 47С). Данное обстоятельство не исключает возможности связывания с зондом фрагментов, обладающих с ним частичной гомологией ДНК. Но, не смотря на мягкие температурные условия гибридизации, положительный сигнал на радиоавтографе свидетельствовал, что нанесенные на данном квадрате мембраны ДНК лептоспирозной природы, а микроорганизмы других видов не давали засветки негативной пленки при радиоавтографии.
Таким образом, показано, что геном лептоспир, как и других биологических объектов является уникальной структурой, которая отражает биологическую сущность данного организма. Поэтому использование информации, заложенной в структуре нуклеиновых кислот, является надежным критерием их идентификации. В местах нанесения ДНК сероваров патогенных лептоспир отмечали положительные сигналы гибридизации в виде темных пятен на рентгеновоской пленке, которые образовывались в результате засветки связавшимся комплементарно с исследуемыми образцами, меченым ДНК-зондом.
Результаты блот-гибридизации Hind III фрагментов тотальной ДНК штаммов лептоспир с ДНК - зондами pLp 23, pLp 37, pLp 41 представлены на рис. 16-18 и таблице 7. С ДНК- зондом pLp 23 идентичные профили гибридизации характерны для штаммов ВГНКИ-4 и ВГНКИ- 3, хотя все производственные и референтные штаммы давали чрезвычайно слабый гибридизационный сигнал. При гибридизации с ДНК-зондом pLp 37 (рис. 17- дорожки N 2,3,4) не отмечено различий у штаммов ВГНКИ-3, ВГНКИ-5, ВГНКИ-2, а для штамма ВГНКИ-1 интенсивная гибридизационная полоса была локализована в верхней части трека рис. 17- дорожка N 5). Следовательно, плазмиды pLp 23 и pLp 37 не пригодны для дифференциации производственных штаммов лептоспир друг от друга. При специфическом "нарезании" ДНК производственных штаммов рестриктазой Hind III обнаруживали уникальное распределение полос после гибридизации с ДНК-зондом pLp 41. Производственные штаммы отличались друг от друга числом, и размером гибридизующихся фрагментов, а также интенсивностью сигналов радиоавтографии (таблица 7 и рис.18). Характерно наличие дискретных полос для штамма ВГНКИ-1 по всему треку и интенсивного гибридизационного пятна для штамма ВГНКИ-4, что указывает на хороший разброс по геному данной клонированной последовательности. Блот-гибридизация Hind III фрагментов ДНК штаммов лептоспир с ДНК-зондом pLp 41 показала идентичные профили гибридизации для производственного штамма ВГНКИ-1 и референтного Moskva V, а в случае гибридизации с ДНК-зондами pLp23, Lp37 профили этих штаммов были различимы. Нельзя точно отличить блот - гибридизацией с ДНК-зондом pLp41 производственный штамм ВГНКИ-3 и референтный Каширский. Однако блот-гибридизация с ДНК-зондом pLp41 различала производственные штаммы ВГНКИ-4, ВГНКИ-5 и ВГНКИ-б серогрупп Tarassovi, Sejroe и Pomona соответственно от их референтных штаммов Perepelicyn, 493 Pland, Pomona. Таким образом, наряду с общими сразу для нескольких штаммов фрагментами каждый производственный штамм лептоспир имел индивидуальный гибридизующийся фрагмент.
Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена
Для объективной оценки иммунного ответа необходимо было установить позитивно-негативный порог (ПНП) реакции.
Для учета результатов реакции рассчитывали процент позитивности по формуле: ПП= (On-NCx)/(PCx-NCx), где ОП- это среднее значение измеренной сыворотки, а РСх - средняя оптическая плотность положительной контрольной сывороткии NCX- средняя оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки. Тестировали по 119 заведомо отрицательных в реакции нейтрализации, в РНГА ко всем пяти респираторным вирусным инфекциям. ПНП определяли, рассчитывая средние значения оптической плотности отрицательных сывороток для разведения 1:50, прибавляя три значения стандартного отклонения (для расчета верхней границы ПНП) и два значения стандартного отклонения (для расчета нижней границы ПНП). Среднее значение оптической плотности отрицательных сывороток (0,126 о.е.), суммированное с утроенным и удвоенным значениями стандартного отклонения, составило 0,261 о.е. и 0,216 о.е. Для данных значений вычисляли S/P - отношение, которое приняли в качестве критерия для разграничения различных типов реакции. Было установлено, что сыворотки следует считать отрицательными, если отношение S/P 0,2, или положительные, если S/P 0,3. Существующий между ними интервал значений соответствовал сомнительным результатам. Для этого были проведены исследования по определению закономерностей распределения значений ОП450 и коэффициента связывания (Ксв.) отрицательных и вирус-положительных сывороток, т.е. порогового значения ("cut off или позитивно-негативный порог - ПНП), разграничивающего положительную и отрицательную реакции ИФА. Установлено, что анализируемые сыворотки, имеющие Ксв. менее 20%, с большой вероятностью (0,98) не содержат вирус-специфических антител. В 98%) вирус-специфических сыворотках значение ОП450 превышало аналогичный показатель отрицательного контроля в 2,1 раза, а Ксв. был более 20% . Исходя из этого, величина ПНП или cut off для Ксв., являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб, при котором минимально количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, составляет 20%). Таким образом, значение Ксв., позволяющего дискриминировать положительные и отрицательные сыворотки методом ИФА, составило 20%. Все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающем этот показатель - положительными. В результате проведенных исследований разработана универсальная методика учета результатов определения антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ в иммуноферментной тест-системе. Одним из важных критериев эффективности использования иммуноферментных тест-систем является воспроизводимость результатов определения, которая проверяется как в рамках одной микропанели (набора ИФА), так и между разными наборами ИФА одной серии и наборами разных серий. Мерой контроля воспроизводимости является значение коэффициента вариации (К.В.), который отражает зависимость между разбросом и среднеарифметическим значением (Методическое руководство, Р.А.Тигранян, Н.Ф.Калита, А.С.Роганов, 1994). Величина коэффициента вариации значений Ксв. при исследовании положительных проб (п=5) наборами разных серий не превышала 6,76%, а при исследовании отрицательных (п=11) - 4,76%, что соответствует рекомендуемым параметрам и не превышает 10%. При этом коэффициент корреляции результатов при исследовании положительных проб составил 0,9, а при исследовании отрицательных - 0,97. Анализ полученных данных, позволил нам сделать вывод, что разработанная тест-система может применяться для массовых скрининговых исследований и проводить мониторинг респираторных инфекции, а также оценивать эффективность применения вакцин в тех хозяйствах, которые проводят целенаправленную специфическую профилактику. Кроме того, данный набор может служить дополнительным средством исследований в системе комплексной диагностики респираторных болезней КРС. Оценка эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC u АВ в сравнении с методами аналогичной направленности Известно, что основными параметрами всех диагностических тест-систем является их чувствительность и специфичность. Поэтому следующим этапом нашей работы было определение этих показателей качества разработанной тест-системы для выявления специфических антител к респираторным вирусам, в сравнении с методами аналогичной направленности. Тест-система была испытана при сравнительном титровании исследуемых сывороток методами РН, РНГА и ИФА для каждой вирусной инфекции соответственно. (Таблицы 24-28)
