Введение к работе
Актуальность темы. Вирус бешенства способен вызвать у человека и животных неизлечимое заболевание, которое, по оценке ВОЗ, входит в группу инфекционных болезней, наносящих значительный ущерб экономике и здравоохранению (WHO Expert … , 2004). Из-за чрезвычайной опасности и абсолютной летальности вопросы профилактики бешенства после повреждения, нанесенного больным или подозрительным на бешенство животным, имеют исключительно важное значение. Существующая во всем мире единая тактика профилактики заболевания после контакта с возбудителем инфекции обеспечивается путем немедленной местной обработки раны с последующим введением антирабической вакцины, а в случаях множественных укусов опасной локализации – в сочетании с антирабическим иммуноглобулином (Селимов, 1986; Мовсесянц и др., 1989; Медуницын, 2005). В Российской Федерации ежегодно за антирабической помощью обращаются 430–470 тысяч человек, больше половины из них получают специфическое антирабическое лечение (Онищенко, 2012).
Для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей в Российской Федерации применяют концентрированную культуральную антирабическую вакцину (КОКАВ) в сочетании с антирабическим иммуноглобулином (АИГ) из сыворотки крови человека. В России рекомендованы к применению и зарегистрированы в Государственном Реестре лекарственных средств гомологичный АИГ (Китай, Франция) и гетерологичный АИГ из сыворотки крови лошади, единственным производителем которого в Российской Федерации является РосНИПЧИ «Микроб». На сегодняшний день АИГ из сыворотки крови лошади можно считать приемлемой и безопасной альтернативой гомологичному иммуноглобулину, получаемому из иммунной сыворотки крови человека, так как использование современных методов очистки иммуноглобулиновых препаратов позволило значительно снизить частоту побочных эффектов, проявляющихся в результате применения АИГ животного происхождения – до 1-2 % (Wilde et al., 1989; WHO Expert … , 2004; Абрамова и др., 2010). Однако даже при сравнительно небольшой доле возникновения побочных эффектов вопрос дальнейшего усовершенствования гетерологичного АИГ остается актуальным.
Среди научно-практических задач, способствующих повышению качества целевого продукта, актуальной является применение на этапе иммунизации продуцентов рабического антигена культурального происхождения взамен органо-тканевого. Применение клеточных культур в качестве основной системы для репродукции фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» должно позволить получить более безопасный очищенный антиген, исключающий риск образования в сыворотке продуцентов антител-нейротоксинов, которые могут быть причиной побочных эффектов у получающих антирабическую помощь пациентов (Селимов, 1978; WHO Expert…, 2004). Переход к использованию культурального рабического антигена на этапе получения гипериммунной сыворотки согласуется с рекомендациями ВОЗ по исключению применения органо-тканевого антигена в производстве антирабических препаратов (WHO Expert … , 2004).
Не менее важным аспектом при поиске путей совершенствования технологии производства антирабического иммуноглобулина является разработка методических подходов для количественной оценки содержания вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале in vitro с помощью полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (ПЦР-РВ). Применение количественной ПЦР-РВ позволит определять содержание вируса бешенства в антигене для иммунизации продуцентов, а также исследовать динамику накопления вируса при его культивировании в культуре клеток.
Высокая востребованность антирабического иммуноглобулина на Российском фармацевтическом рынке, обусловленная неблагоприятной эпизоотологической и эпидемиологической ситуацией по бешенству, дают основания считать актуальными исследования по совершенствованию технологии производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
Степень разработанности проблемы. В настоящее время в биотехнологической практике при производстве антирабических вакцин репродукцию вируса бешенства успешно осуществляют на различных клеточных системах: первичнотрипсинизированных и перевиваемых клетках почек сирийского хомяка (Селимов, 1978; Иванов, 2001), куриных и перепелиных фибробластах (Нагиева, 1980; Madhusudana, 2002), зародышевых клетках свиньи, собаки (Perez, 1997), диплоидных клетках человека (Brookes, 2005), клетках почек сайги (Груздев, 1997), клетках почечного эпителия зелёной мартышки (Vero) (Шафеева, 1995; Петрова, 2005; Barret, 2009). Использование для ПЦР-РВ зонда, меченного флуоресцентными метками, и дополнительная амплификация количественно охарактеризованных проб нашли успешное применение для определения концентрации РНК вируса диареи крупного рогатого скота (Kosinova, 2007); жёлтой геморрагической лихорадки, человеческого герпес вируса–6 и цитомегаловируса (Radonic, 2005); для количественной оценки антигена Е вируса клещевого энцефалита в культуре клеток (Морозова, 2012); для количественного определения вакцинных штаммов вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи (Аммур, 2012) и др.
По данным литературы установлено, что на сегодняшний день отсутствует способ количественной оценки вируса бешенства в инактивированном антигенном материале.
Таким образом, актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру исследования.
Цель работы: разработка биотехнологических приемов масштабированного выращивания культурального фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» и способа его количественной оценки.
Задачи исследования:
1. Экспериментально обосновать технологические параметры культивирования фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на культуре клеток перевиваемой линии Vero.
-
-
-
Разработать методические подходы для количественного определения вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
-
Усовершенствовать технологические приемы по инактивации, очистке и концентрированию культурального вируса бешенства.
-
Оценить перспективы применения культурального рабического антигена для получения специфических сывороток.
-
Получить экспериментальные серии антирабического иммуноглобулина с применением культуральных технологий и исследовать его физико-химические и биологические параметры на соответствие требованиям нормативной документации.
Научная новизна заключается в том, что впервые фиксированный вирус бешенства штамма «Москва 3253» репродуцирован на клетках перевиваемой линии Vero. Экспериментально обоснованы технологические параметры культивирования вируса стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами.
Впервые в отечественном производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина для иммунизации продуцентов предложено использование рабического антигена на основе культурального вируса бешенства штамма «Москва 3253» взамен органо-тканевого антигена.
Впервые разработаны методические подходы для количественной оценки содержания вируса бешенства штамма «Москва 3253» в рабическом антигене с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Практическая значимость работы
По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета №5 от 23.09.10), «Количественное определение фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в вируссодержащем материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Концентрирование инактивированной суспензии культурального фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» методом тангенциальной ультрафильтрации» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» суспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» псевдосуспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11).
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам профилактики бешенства человека; современным методам производства антирабических препаратов, соответствующих рекомендациям ВОЗ; количественной оценки вирусов методом ПЦР-РВ в вируссодержащем материале при выявлении вирусных заболеваний различной этиологии. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.
При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.
Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанные биотехнологические приемы обеспечивают репродукцию фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой клеточной линии Vero стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами культивирования.
2. Экспериментально обоснованная методика проведения инактивации, очистки и концентрирования вирусного урожая при масштабированном культивировании вируса бешенства «Москва 3253» в условиях биореактора позволяет получить культуральный рабический антиген для иммунизации продуцентов, по антигенным свойствам не уступающий органо-тканевому.
3. Применение культурального рабического антигена для иммунизации продуцентов позволяет получать иммунные специфические сыворотки с уровнем защитных антител, соответствующим регламентированному значению.
4. Специфический иммуноглобулин, полученный с использованием культуральных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствует требованиям нормативной документации на антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади.
5. Разработанные методические подходы позволяют определять количество вируса бешенства «Москва 3253» в материале для иммунизации продуцентов с помощью полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов.
Работа выполнена в лаборатории профилактических иммуноглобулинов и лаборатории генодиагностических препаратов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014) «Разработка технологии масштабированного культивирования вируса бешенства для получения культурального рабического антигена» (номера госконтрактов 63-Д от 29.06.2010, 73-Д от 25.07.2011, 54-Д от 04.06.2012).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (2007, 2008, 2011, 2012, 2013); юбилейной научно-практической конференции, посвящённой 100-летию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 2009); X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012); научно-практической конференции Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 11 апреля 2012); Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: материалы» (Пермь, 2012); VI Региональной научно-практической конференции «Перспективы использования в медицинской практике новых иммунобиологических препаратов, полученных на основе клеточных культур» (Екатеринбург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (к 100-летию СГАУ имени Н.И. Вавилова) (Саратов, 2013).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и пратическую значимость.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследований, результатов и обсуждений, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 190 источников, в том числе 83 – отечественных и 107 – зарубежных. Объем диссертации составляет 118 страниц машинописного текста, включает 22 таблицы, 18 рисунков.
Похожие диссертации на Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина
-
-
