Введение к работе
Актуальность темы
Одним из основных способов диагностики инфекционных заболеваний является серологическое обследование пациентов с целью выявления маркеров (антител классов IgG и IgM) к отдельным возбудителям При смешанных инфекциях, когда организм поражается сразу несколькими возбудителями, а также для дифференциации заболеваний, имеющих сходную клиническую картину, необходимо выполнение нескольких иммунологических тестов В настоящее время такое обследование проводится при помощи моноспецифических тест-систем.
Многопрофильная иммунодиагностика — новое направление, предполагающее использование устройств, так называемых «белковых матриц» (protem arrays), позволяющих одновременно определять в исследуемом образце множество различных антител. Часто такие матрицы называют «белковыми чипами» или «иммуночипами» Белковая матрица для многопрофильного анализа антител представляет собой плотную подложку с дискретно нанесенными в определенном порядке антигенами различных возбудителей инфекционных заболеваний Результаты после выполнения дот-иммуноанализа на матрицах расшифровываются по наличию сигнала в точно пространственно определенных зонах нанесения антигенов Белковые матрицы имеют большой потенциал, как универсальные инструменты в биомедицинских исследованиях и клинической медицине Однако большинство предлагаемых устройств подобного рода предполагает размещение больших белковых библиотек на миниатюрных подложках, роботизацию процесса изготовления и применения матриц Такой подход требует новых дорогостоящих технологий, материалов, оборудования и поэтому в широкой клинической практике пока не используется
Одним из факторов, тормозящих развитие многопрофильной иммунодиагностики, является разнообразие существующих антигенов, для работы с которыми часто требуется подбор индивидуальных условий Успехи последних лет в развитии иммунохимии, в частности получение рекомбинантных антигенов, а также разработка эффективных способов наработки, выделения и очистки натуральных белков, позволяют в значительной степени унифицировать их свойства и сделать возможным их совместное использование в многопрофильном анализе
Перспективной областью применения белковых матриц в практической медицине является комплексное обследование беременных женщин и новорожденных детей на наличие у них спектра сывороточных антител к инфекционным заболеваниям, негативно влияющим на здоровье матери и ребенка Большинство заболеваний перинатального периода характеризуются широким распространением среди населения, множественностью путей заражения, частым сочетанием двух и более возбудителей, а также скудностью и неслецифичностью клинической симптоматики Поэтому для достоверной диагностики таких заболеваний требуется дополнительное лабораторное обследование
Для проведения такого обследования необходима постановка ряда анализов на моноспецифических тест-системах, поэтому оно представляет собой длительную, трудоёмкую и дорогостоящую процедуру Следует отметить, что для выполнения иммуноферментньгх анализов требуется специальная дорогая аппаратура и высокая квалификация персонала. В настоящее время такое обследование проводится только в крупных, как правило, городских учреждениях здравоохранения. Оперативная
доставка образцов из отдаленных населенных пунктов, особенно в условиях сибирского бездорожья, представляет большую трудность Поэтому, значительная часть населения фактически лишена возможности серологического обследования с целью выявления инфекционной угрозы и своевременной ее ликвидации
Таким образом, создание недорогого и простого в исполнении многопрофильного серологического теста, позволяющего оперативно проводить комплексное серологическое обследование беременных женщин, в том числе и в условиях слабо оснащенных сельских медицинских пунктов, позволит сделать такое обследование более доступным, массовым, своевременным и эффективным
Усовершенствование диагностики инфекций перинатального периода является важной социальной задачей, поскольку напрямую связано со здоровьем рождающихся детей и в перспективе определяет здоровье населения страны
В этой работе мы попытались реализовать подход, сочетающий многопрофильность с простотой изготовления и применения белковых матриц
Цель и задачи исследования
Цель исследования - разработка подходов и методических приемов для изготовления и применения многопрофильного теста, позволяющего осуществлять комплексное обследование беременных женщин и новорожденных детей на наличие у них спектра сывороточных антител класса IgG к возбудителям инфекций перинатального периода.
Поставленная цель подразумевает решение следующих задач
выбор формата и общей стратегии выполнения многопрофильного теста,
оценку целевых свойств материалов для изготовления подложки (твердой фазы),
подбор антигенов по номенклатуре теста,
отработку способа и условий иммобилизации антигенов на твердой фазе,
создание прототипа белковой матрицы,
оценку способов получения и усиления визуального сигнала,
отработку схемы и условий проведения многопрофильного анализа,
создание и лабораторные испытания прототипа многопрофильного теста.
Научная новизна и практическая ценность работы
Обоснован выбор формата белковой матрицы и общей стратегии бесприборного многопрофильного анализа антител
Проведена экспериментальная оценка целевых свойств материалов для изготовления подложки белковой матрицы
Исследованы целевые свойства коммерчески доступных антигенов и произведен отбор антигенов, пригодных для использования в многопрофильном тесте
Экспериментально подобраны условия подготовки поверхности твердой фазы и иммобилизации на ней антигенов
Проведена сравнительная экспериментальная оценка наиболее перспективных вариантов хромогенной визуализации и усиления сигнала.
Отработана общая схема и оптимизированы условия выполнения многопрофильного теста с использованием конъюгатов на основе коллоидного золота и усилением сигнала серебряным проявлением
Сконструирован и испытан прототип белковой матрицы для одновременного выявления антител класса IgG к 8 возбудителям инфекций перинатального периода.
Проведены лабораторные испытания прототипа многопрофильного теста.
Разработана концепция набора для многопрофильного анализа, получен Патент РФ на "Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа"
Основные результаты, выносимые на защиту
-
Теоретическое и экспериментальное обоснование выбора формата белковой матрицы и общей стратегии бесприборного многопрофильного анализа антител
-
Экспериментальное обоснование выбора материала для изготовления подложки белковой матрицы
-
Методология изготовления белковой матрицы
-
Методология проведения многопрофильного дот-иммуноанализа с применением конъюгатов на основе коллоидного золота и усилением сигнала серебряным проявлением
-
Концепция набора для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям инфекций перинатального периода методом дот-иммуноанализа.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на следующих конференциях Международная научная конференция «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» и Междисциплинарный семинар "Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций", (Санкт-Петербург, 2-5 ноября 2004 года), Научно-практическая конференция с международным участием "Серебро и висмут в медицине" (Новосибирск, 25-26 февраля 2005 года), Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 года), Ш Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск 27-29 сентября 2006 года)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах и получено 2 патента РФ
Структура и объем диссертации
